一氧化二氮（N2O）也能当“食物”？淡水蓝藻Nostoc sp. MS1通过固氮酶同化温室气体新机制
《Frontiers in Microbiology》：Assimilatory N2O reduction by Nostoc sp. strain MS1 isolated from a river: insights from genome and 15N tracer analysis
编辑推荐：
本文首次报道了从淡水河流中分离得到的一株念珠藻Nostoc sp. MS1，其能够通过固氮酶（nifDKH）活性，将强效温室气体一氧化二氮（N2O）同化为生物质氮。基因组与15N示踪分析证实，该菌株缺乏典型的N2O还原酶（nosZ）基因，其N2O同化途径涉及将N2O先还原为N2再固定，且该过程在有一定氧气存在时仍可进行。这项研究揭示了一种此前未知的、由蓝细菌介导的淡水环境N2O汇，为利用微生物减缓温室气体排放提供了新思路。
引言：被忽视的淡水N2O汇
一氧化二氮（N2O）是一种强效温室气体，其全球变暖潜能值是二氧化碳（CO2）的273倍，同时也是一种消耗臭氧层的物质。其主要人为来源包括农业耕地、生物质焚烧和废水处理。过去四十年间，大气N2O浓度持续上升，对全球气候构成严重威胁。因此，寻找和开发有效的N2O减排策略至关重要。
在自然界和人工生态系统中，N2O的消耗主要依赖于含有N2O还原酶功能基因（nosZ）的反硝化和非反硝化细菌。然而，这类酶的活性极易受到环境条件的影响，特别是在有氧条件下会失活，限制了其在好氧-微好氧环境中作为N2O“汇”的效能。因此，探索不依赖nosZ、且对氧气具有更高耐受性的N2O消耗机制具有重要意义。
蓝藻广泛分布于自然环境中，是海洋和淡水生态系统初级生产的重要贡献者，其中许多种类具有固氮能力。已有研究表明，一些海洋固氮蓝藻（如束毛藻Trichodesmium spp.）和某些细菌可以利用N2O作为氮源。然而，尽管淡水环境的N2O排放量远高于海洋环境，但从未有研究报道从淡水环境中分离出能够同化N2O的蓝藻纯培养菌株。这引出了一个关键的科学问题：淡水环境中是否存在能够同化N2O的蓝藻？如果存在，它们的作用机制是什么？对氧气和氮气的耐受性如何？
为解答这些问题，本研究提出以下假设：1）淡水环境中存在能够吸收N2O的蓝藻；2）N2O被转化为N2后再固定同化（或直接转化为氨同化）；3）存在比典型反硝化N2O还原菌对氧气耐受性更高的蓝藻。为此，研究人员从日本茨城县氮污染的堀田河采集水样，启动了一项旨在分离和鉴定此类微生物的研究。
材料与方法：从富集到精准分离
研究首先对河流水样进行富集培养。样品在无外源有机碳、交替光照/黑暗的条件下，于含有大气氮气（N2）且无氧气（O2）的瓶中进行为期40天的初步富集，旨在富集能利用N2的微生物。随后，将富集物转移至以氦气（He）、二氧化碳（CO2）和微量N2O为顶空气体的BG011培养基中继续培养68天，以特异性富集能利用N2O的微生物。监测显示N2O被消耗，表明富集成功。
为获得纯培养菌株，研究采用了荧光激活细胞分选技术。基于蓝藻细胞含有叶绿素具有自发荧光，以及目标菌株呈串珠状（moniliform）丝状形态的特点，研究人员通过前向散射（反映细胞大小）和PerCP-Cy5.5荧光通道（反映叶绿素荧光强度）来区分和分选细胞。经过两轮分选和后续的96孔板培养，最终获得了一株纯培养的蓝藻菌株。
系统发育与基因组特征：命名与代谢潜能解析
通过16S rRNA基因测序和系统发育分析，该分离菌株被鉴定为念珠藻属的一个新菌株，命名为Nostoc sp. strain MS1，并保藏于日本微生物菌种保藏中心。系统发育树显示，其与Nostoc sp. CAVN2和Nostoc sp. NIES-2111亲缘关系最近。
研究人员进一步利用牛津纳米孔长读长和Illumina短读长测序技术，构建了该菌株的高质量基因组草图。基因组分析揭示了其代谢潜能的关键特征：
- 1.
固氮与氮同化：拥有完整的固氮酶基因簇（nifDKH），编码钼铁蛋白，用于将N2转化为NH3。同时拥有同化型硝酸还原酶（narB）和亚硝酸还原酶（nirA）基因，以及氨转运蛋白（amt）和硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白（nrt）基因，具备完整的谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合酶途径，用于氮同化。
- 2.
缺乏典型N2O还原途径：通过PCR和基因组扫描，均未发现编码N2O还原酶（Nos）的基因，包括nosZ clade I, II和III。这表明菌株MS1不进行典型的呼吸型N2O还原。
- 3.
中心代谢：拥有糖酵解和卡尔文循环的全部基因。三羧酸循环不完整，但拥有2-酮戊二酸脱羧酶和琥珀酸半醛脱氢酶基因，构成一个支路。此外，还拥有NADP+依赖的苹果酸脱氢酶基因。
- 4.
氧气耐受机制：基因组中含有异形胞分化相关基因（hetR, hetF, ntcA），暗示其可能形成异形胞，在好氧条件下为固氮酶创造厌氧微环境。此外，还拥有黄素二铁蛋白基因（flv1A, flv1B, flv3A, flv3B），这些蛋白定位于异形胞，可能参与清除氧气，保护固氮酶。菌株还拥有细胞色素P450类似蛋白基因，可能与一氧化氮还原为N2O有关。
- 5.
产氢与氧化还原平衡：拥有编码可逆性和吸收性氢化酶的基因（hoxHYUF, hupLS），可能与光合作用产氧的耦合有关。
N2O同化能力的直接证据：15N示踪实验
为了直接证明Nostoc sp. MS1能够同化N2O，研究采用了15N稳定同位素示踪技术。将菌株在含有15N标记的N2O（46N2O）的顶空气体（He/CO2）中培养12天。结束后，测量菌体生物质中的15N原子百分比。
结果表明，Nostoc sp. MS1细胞中的15N含量显著高于自然本底值，明确证实了其能够吸收并同化N2O中的氮。研究还测试了其他10株来自保藏中心的淡水固氮蓝藻，发现其中Aulosira laxa, Calothrix brevissima和另一株Nostoc sp.也表现出不同程度的15N2O同化能力，而其他菌株则没有，这表明N2O同化能力在蓝藻中并非普遍存在，存在种间甚至株系差异。
固氮酶的关键作用：乙炔还原实验关联
为了探究N2O同化是否与固氮酶有关，研究并行进行了乙炔还原测定。乙炔是固氮酶的竞争性抑制剂，可被还原为乙烯。实验发现，不同蓝藻菌株的N2O同化程度（15N富集量）与其固氮酶活性（乙烯产率）呈显著正相关。
这一强烈的正相关性为“固氮酶参与了Nostoc sp. MS1对N2O的同化”这一推论提供了关键的支持性证据。尽管未进行体外纯化酶实验，但体内实验结果强烈暗示固氮酶是催化N2O转化的关键酶。
环境因子的影响：氧气与氮气的竞争
理解环境因子如何影响N2O同化，对于评估其生态意义至关重要。研究通过控制实验，探究了氧气（O2）和氮气（N2）的影响。
- 1.
氧气（O2）的影响：在含有100 ppm 15N2O，但O2分压（PO2）分别为0%、5%、20%和30%的条件下培养菌株MS1。
结果显示，在所有O2水平下，菌株MS1均能同化N2O，这与典型反硝化细菌的Nos酶在好氧条件下失活的现象形成鲜明对比。然而，随着O2分压升高，细胞对N2O的同化量逐渐下降，而生物量产量增加。这表明O2抑制了N2O的同化，可能是因为菌株在有氧条件下进行呼吸作用获取能量更为有利，降低了对N2O同化的依赖。其耐受氧气的机制可能与异形胞和黄素二铁蛋白的氧气清除功能有关。
- 2.
氮气（N2）的竞争效应：为了探究N2O是同化为N2再固定，还是直接同化，以及N2是否存在竞争抑制，研究设置了对比实验：Run A（顶空为N2/CO2/15N2O）和Run B（顶空为He/CO2/15N2O）。
结果非常有趣：
- •
N2对N2O同化的竞争：Run A（有N2）的15N2O消耗速率比Run B（无N2）降低了约60%，表明N2和N2O在竞争固氮酶的底物结合位点。
- •
N2O转化为N2：在Run A和Run B的顶空中，都检测到了30N2（由两个15N原子组成）的积累，而无菌对照中则没有。这直接证明Nostoc sp. MS1能够将15N2O转化为15N2。
- •
氮的去向：对消耗的N2O进行氮平衡计算。
在Run B（无N2）中，产生的30N2和固定到生物质中的15N之和，约占消耗N2O的74%，其中约一半的N2O被同化。在Run A（有N2）中，产生的30N2和固定氮之和占消耗N2O的127%，但大部分氮以30N2形式释放到顶空，被同化的比例很低。这些结果表明：第一，Nostoc sp. MS1同化N2O的途径是将其先还原为N2，然后再由固氮酶固定，支持了研究的第二个假设。第二，当环境中存在丰富的N2时，菌株优先利用N2，并将大部分N2O转化为N2而非同化，导致了氮的“溢出”。
讨论与展望：一种新的淡水N2O汇
本研究首次成功分离并鉴定了一株能够同化强效温室气体N2O的淡水蓝藻纯培养菌株——Nostoc sp. strain MS1。结合基因组学、15N稳定同位素示踪和生理学实验，系统阐明了其N2O同化的机制、关键酶及其对环境因子的响应。
主要发现与意义：
- 1.
发现新的N2O消耗微生物：证实了淡水环境中存在不依赖经典nosZ基因的蓝藻，能够通过固氮酶途径同化N2O，这为淡水生态系统N2O收支平衡增加了一个此前被忽略的“汇”。
- 2.
阐明同化机制：揭示了Nostoc sp. MS1同化N2O的途径是“先还原后固定”，即固氮酶将N2O还原为N2，随后再将N2固定为氨并同化为生物质。这解决了关于微生物同化N2O路径的争议。
- 3.
评估环境适应性：发现该菌株的N2O同化过程对氧气具有一定耐受性，这与严格厌氧的典型反硝化型N2O还原菌显著不同，使其在好氧-微好氧的淡水环境（如表层水体、沉积物界面）中可能发挥作用。同时，N2会与N2O竞争固氮酶，这意味着在富氮环境中，其N2O汇的潜能可能被抑制；而在氮受限但存在N2O污染的环境中，其作用可能更突出。
研究方法创新：本研究成功将荧光激活细胞分选技术应用于淡水蓝藻的分离，结合其形态和自发荧光特征，为分离难培养的、具有特定功能的淡水微生物提供了新策略。
生态与应用潜力：全球河流系统是重要的N2O排放源。本研究发现，念珠藻属及其近缘的鱼腥藻属等蓝藻可能构成河流和河口地区一个未被认识的N2O生物过滤层。尽管其单位生物量的N2O固定速率远低于异养反硝化细菌的N2O还原速率，但蓝藻作为初级生产者，可以通过光合作用增殖，在适宜条件下可能形成可观的生物量，从而对局部N2O通量产生调节作用。这为了解淡水生态系统氮循环和温室气体代谢提供了新的视角。
未来展望：后续研究需要深入评估这类N2O同化蓝藻在自然淡水生境（如河流、湖泊、池塘）中的丰度、活性及其对全球N2O预算的实际贡献。此外，解析其黄素二铁蛋白和细胞色素P450类似蛋白在调节细胞内氧化还原状态和氮氧化物代谢中的具体功能，将有助于更全面地理解其环境适应策略。最终，这些基础认知可能为开发基于蓝藻的、针对农业径流或污水处理尾水等氮污染热点区域的N2O生物减缓技术提供理论依据和菌种资源。
