《Frontiers in Forests and Global Change》：Infrared spectroscopy enables rapid identification of Scots pine resistant to Diplodia sapinea
编辑推荐：
这篇综述性研究评估了手持式傅里叶变换红外（FT-IR）光谱作为一种快速、无损的筛选工具，在感染前识别欧洲赤松（Scots pine）对松枯梢病菌（Diplodia sapinea）抗性相关化学特征的能力。通过结合稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）与支持向量机（SVM）的工作流程，该研究在区分抗性/感病个体上取得了65–81%的交叉验证准确率。结果表明，手持FT-IR光谱能够捕获本构防御化学中具有生物学意义的变异，为松树育种项目中的抗性表型鉴定提供了一种可扩展的快速方法。
引言
全球森林正经历着前所未有的病害压力，这是由生物入侵、加剧的气候胁迫和病原体行为转变共同驱动的。其中，葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）的潜伏真菌引起的溃疡病和顶枯病爆发尤为突出。松枯梢病菌（Diplodia sapinea）是该科的一个主要成员，能在松树的所有组织和生命阶段引起枝枯病和溃疡病。在气候极端事件预计增加的背景下，识别对松枯梢病菌具有更高天然耐受性或抗性的松树基因型，应成为森林健康和育种项目的优先事项。
利用天然宿主抗性仍然是缓解地方性和入侵性病原体所致病害最可持续的长期策略。在松树中，对松枯梢病菌的抗性与初级和次级代谢的协同变化有关，包括酚类途径和基于萜烯的防御的改变。然而，将这些防御性状转化为可操作的育种一直具有挑战性。传统的抗性筛选依赖于破坏性接种测定和多年的田间试验，使得该过程缓慢、劳动密集且难以扩大规模。因此，亟需能够检测与宿主抗性相关的生物化学特征的快速、非破坏性表型分析工具。
振动光谱，包括傅里叶变换红外（FT-IR）、近红外（NIR）和拉曼光谱，已成为捕获植物组织广泛化学指纹的有前景的解决方案。红外光谱通常能捕捉到细胞壁组成、酚类、脂质和蛋白质中微妙但有生物学意义的差异，这些差异与抗性表达有关。当与化学计量学或机器学习方法结合时，红外光谱提供了评估与抗性相关的复杂生化性状的可能性。
尽管先前的研究已在多个森林病害系统中成功应用红外光谱进行表型分析，但大多数依赖于台式FT-IR系统和大量的样品制备，这限制了现场部署和操作的可扩展性。手持式FT-IR光谱仪可能为快速树木抗性表型分析提供了一种强大但未充分利用的工具。
材料与方法
本研究使用了来自瑞典欧洲赤松育种计划的34个半同胞家系的四年生盆栽幼苗。在2023年和2024年，分别对192棵和185棵树进行了人工接种。在接种前，立即采集了主干韧皮部、一个单独的伸长枝条和四根当年生针叶用于光谱分析。所有样品均使用配备金刚石衰减全反射（D-ATR）接口的安捷伦4300手持式FT-IR光谱仪进行扫描。
在化学计量学和机器学习分析方面，遵循了一个连续的工作流程，包括：（i）光谱预处理，（ii）探索性主成分分析（PCA），（iii）使用稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）进行特征选择，以及（iv）在缩减的数据集（即sPLS-DA选定的波数）上使用支持向量机（SVM）进行监督分类。光谱经过二阶导数处理，并修剪以去除噪声区域。
结果
病斑长度在组织和年份之间基本一致。当根据病斑长度四分位数将树木划分为相对抗性类别时，无论使用哪一年或哪种组织进行表型分配，被分类为抗性的树木的病斑始终显著小于感病树木，表明用于建模的树木在其相对症状上存在内在差异。
对二阶导数FT-IR光谱的主成分分析（PCA）显示，组织类型和实验年份在前两个主成分上存在强烈分离，其中与年份相关的分离在针叶和枝条组织中最为明显。相比之下，抗性、中间型和感病表型并未形成明显不同的簇，表明与抗性相关的化学差异相对于组织类型和年份的主导变异而言是微妙的。
通过sPLS-DA将完整的FT-IR光谱从899个波数减少到189个信息波数的子集，仍然使得SVM模型在跨年份和组织中实现了相对较高的预测性能。尽管进行了大幅度的降维，许多模型仍达到了0.60-0.89的测试准确率，表明缩减的波数集保留了预测抗性表型的强大判别能力。基于交叉验证（CV）准确率，最佳模型出现在2023年，使用所有病斑平均长度（All）和侧枝（Shoots）表型结合枝条（shoot）光谱时，CV准确率分别达到80%和81%。在合并年份的数据后，使用所有病斑平均长度（All）表型，结合枝条或韧皮部（phloem）组织的光谱，模型性能最佳（均为71%准确率）。无论年份或表型组织如何，枝条组织几乎总是最佳的预测组织。
sPLS-DA最常选择的波数可大致分为四个生化分组：1）细胞壁多糖（1000–1050 cm?1）；2）纤维素/半纤维素键合（1140–1160 cm?1）；3）酚类和蛋白质（1570–1680 cm?1）；4）脂肪族脂质/角质（2950–3140 cm?1）。这些化学域与已知的针叶树防御途径有很强的重叠。
讨论
本研究表明，FT-IR光谱结合化学计量学建模，可以仅基于本构化学，以有希望的准确率（65–81% CV）预测欧洲赤松对松枯梢病菌的相对抗性。我们的结果与甚至略优于其他基于红外光谱预测针叶树抗性水平的研究。我们使用便携式设备扫描完整组织的成功，对于实际抗性筛选是一个重要的结果：育种者需要快速、非破坏性和接种前的方法，而本构性状为大规模操作表型分析提供了最可行的目标。
一个贯穿所有分析的一致结果是，枝条组织提供了最强和最稳定的预测性能。这与生物学预期相符，因为顶芽和侧枝是量化病斑发展（即抗性）的组织。由于预测化学和表型性状源自同一器官，枝条很可能反映了与松枯梢病菌相互作用最相关的生理环境。
基于顶梢（Leader）表型的模型始终不如基于侧枝（Shoots）表型或综合（All）表型的模型准确。一个关键的方法学因素可能是，FT-IR光谱专门从非顶梢组织收集，因为顶梢不能同时被扫描和接种。此外，在松树中，顶梢和侧枝在发育上存在已知差异，这可能导致组织解剖结构和化学组成的不同，从而限制了化学信息在顶梢和侧枝之间的可转移性。
强烈的年份效应在光谱的PCA和模型性能中都很明显：基于2023年数据集训练的模型始终比基于2024年的模型更准确，而基于合并数据集训练的模型表现居中。PCA中清晰的年份水平分离表明，这些基线化学差异足以降低跨年模型的普遍适用性，强调了在开发基于FT-IR的表型分析工具时考虑年际化学变化的重要性。
对模型性能最重要的波数的生化解释虽然有限，但可以提供对相对抗性潜在机制的洞察。sPLS-DA最常选择的波数属于四个主要光谱区域，分别代表细胞壁多糖、酚类和蛋白质、以及脂肪族脂质/角质。这些化学域与已知的针叶树防御相关途径（包括结构强化、酚类介导的抗真菌活性以及角质或木栓化屏障）高度重叠。这些生化分组在不同模型间的一致性支持了以下结论：对松枯梢病菌的抗性具有强大的本构化学特征，FT-IR可以可靠地检测到。
虽然在家系间检测到病斑长度的显著差异，但本研究并非旨在提供遗传分化的决定性测试或量化可遗传的抗性。然而，家系水平差异的存在表明，在瑞典欧洲赤松材料中可能存在对松枯梢病菌易感性的固有变异。从应用的角度来看，本研究的目标并非解决抗性的遗传基础，而是评估是否可以使用本构化学指纹在单株水平上直接识别抗性相关表型。这种表型分析方法独立于家系结构或种源运行，允许在不事先了解遗传信息、谱系记录或群体水平推断的情况下识别抗性个体。
本研究中病害的发展是使用人工接种方法诱导的，该方法会对树木造成创伤并提供相对较大的接种量。虽然这种方法对于松枯梢病菌已建立良好，并为比较表型分析提供了一致的基础，但它并未复制病原体在自然界中的主要感染策略。在田间条件下，松枯梢病菌通常作为潜伏的内生菌存在，主要在宿主树木经历非生物胁迫（尤其是干旱或冰雹损害）时变为致病菌，此时预先存在的内部接种物会迅速定殖宿主组织。相比之下，本实验设计施加了即时且同步的感染压力，这可能有利于预形成、本构防御的表达，而非胁迫诱导的反应。因此，本研究中识别的抗性表型应被解释为急性感染条件下的相对抗性，而非跨所有胁迫介导的病害情景的全面抗性。
结论
FT-IR光谱为预测欧洲赤松对松枯梢病菌的相对抗性提供了一种快速、高通量且具有生物学可解释性的方法。枝条组织提供了最强的预测信号，顶梢组织表现不同且更难以建模，而显著的年份间变异突出了物候和环境背景的重要性。总之，这些结果支持将基于FT-IR的化学表型分析整合到早期育种流程中，为加速抗性筛选和改善长期森林健康管理提供了一种实用工具。
