《Frontiers in Plant Science》：Analysis of the aspartic protease gene family in Nicotiana benthamiana and its application in recombinant protein expression
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本期推荐的文章《Analysis of the aspartic protease gene family in Nicotiana benthamiana and its application in recombinant protein expression》聚焦植物分子农业的关键瓶颈。研究首次在本生烟（Nicotiana benthamiana）中进行了天冬氨酸蛋白酶（APs）基因家族的全面基因组学鉴定与功能解析，揭示了特定NbAPs成员对重组蛋白的降解作用，并通过病毒诱导基因沉默（VIGS）技术验证了沉默靶基因可显著提升外源蛋白积累。该工作不仅为理解植物APs的多样性与功能提供了重要资源，更为优化本生烟作为高效生物反应器平台、推动植物基生物制药产业发展提供了直接的分子靶点与理论依据。
引言
天冬氨酸蛋白酶（APs）是一类在真核生物中广泛分布的水解酶，因其活性位点含有两个保守的天冬氨酸残基而得名。在植物中，APs在生长、发育、应激反应及蛋白质代谢中扮演着核心角色。根据MEROPS数据库的分类，植物APs主要属于A1家族（胃蛋白酶样家族），并可进一步划分为典型、非典型和珠心蛋白样三类。典型植物APs的结构最为独特，其前体蛋白包含N端疏水信号肽、抑制性前导肽、两个成熟的蛋白酶结构域以及一个植物特异性插入（PSI）结构域。PSI结构域不仅参与蛋白质的正确折叠，还在病原防御、盐旱胁迫响应及亚细胞定位等多种生物学过程中发挥作用，尤其被认为是调控典型APs液泡分选的关键信号之一。
本生烟作为一种重要的“植物工厂”平台，被广泛用于重组蛋白的生产。然而，其内源的APs会降解具有价值的重组蛋白，成为限制产量的主要瓶颈。在农杆菌浸润本生烟叶片后，外源基因虽能高效表达抗体、疫苗、酶等高价值蛋白，但植物固有的蛋白酶系统（尤其是APs）会降解这些重组蛋白，导致产量降低或活性丧失。APs造成的降解风险与其亚细胞定位密切相关。定位在液泡的APs通常被液泡膜与胞质或分泌途径中的重组蛋白分隔，但在细胞遭遇渗透胁迫或发生程序性死亡时，液泡破裂会导致酶泄漏并引发广泛降解。相比之下，定位在质外体的APs则能在运输过程中或分泌后直接降解重组蛋白，构成最直接的威胁。因此，全面解析本生烟中AP基因家族的特性，对于制定策略以减少重组蛋白降解、提高产量至关重要。
本研究首次在本生烟中进行了AP基因家族的全基因组鉴定、系统进化分析及功能表征，旨在阐明其多样性、潜在生物学功能，并通过实验验证特定成员对重组蛋白稳定性的影响，为优化本生烟生物反应器平台提供理论基础与分子靶点。
材料与方法
本研究使用的实验材料为中国农业科学院保存的本生烟种子。植物在16小时光照/8小时黑暗、25°C的光周期条件下生长。四周龄植株用于农杆菌浸润实验。
为鉴定APs基因家族成员，首先从TAIR数据库下载了所有拟南芥APs家族成员的蛋白序列。通过Pfam数据库分析表明，它们通常具有保守结构域PF00026。随后，从Nicomics网站下载了本生烟基因组和蛋白文件（NbeHZ1版本）。使用来自Pfam数据库的APs基因家族隐马尔可夫模型（HMM）文件，通过hmmsearch程序以1e-20的E值阈值进行搜索。同时，以AtAP家族蛋白序列为查询，通过BLAST以1e-5的E值搜索潜在的NbAP候选序列。将两种方法获得的蛋白序列合并、去重后，上传至CDD和SMART进行结构域验证，以去除缺乏PF00026结构域的序列。若存在多个剪接变体，则仅保留最长的转录本亚型用于后续分析。利用Expasy在线平台的ProtParam工具确定了NbAP蛋白成员的各种理化性质，包括蛋白长度、分子量、等电点、脂肪族氨基酸指数和总平均亲水性（GRAVY）。NbAP基因根据其染色体位置进行命名。
使用MEGA11构建AP蛋白的系统进化树。序列比对采用ClustalW方法，排除比对结构域之外的非保守区域。采用最大似然法构建系统发育树，bootstrap值为1000。
利用在线工具MEME预测NbAP蛋白中的保守基序。基序长度设置为6-100个氨基酸，最大识别基序数为10，其他参数保持默认值。通过批处理CD-Search分析NbAP家族，并使用TBtools可视化其蛋白保守结构域。基于NbAPs基因家族成员的基因组DNA和CDS序列进行基因结构分析，并使用在线基因结构显示服务器2.0进行可视化。
从基因组序列文件中提取转录起始位点上游2000 bp的区域。使用PlantCARE软件分析这些启动子区域中的顺式作用元件。最后，使用TBtools将NbAP基因启动子区域中所有识别出的元件以热图形式呈现。
从本生烟NbeHZ1基因组GFF3文件中提取AP基因的起始和终止位置信息，并使用TBtools将其映射到相应的染色体上。对于NbAPs的种内分析，使用TBtools中的Fasta Tools和Blast工具，结合染色体长度文件、基因位置文件和相应的比对文件。使用One Step MCScanX工具分析APs，E值设为1e-5。所得的共线性文件用于片段复制基因分析，串联文件用于检测串联重复基因分析。使用KaKs_Calculator 3.0软件计算NbAP基因家族内同源基因对的非同义替换与同义替换比率（Ka/Ks）。
基于保守序列特征，本研究为NbAP46、NbAP47和NbAP79设计了VIGS片段，并通过同源重组技术将其构建到VIGS载体pTRV2中，然后与pTRV1共转化入本生烟。携带pTRV1或重组pTRV2质粒的根癌农杆菌单菌落分别接种于含相应抗生素的YEP液体培养基中，于28°C振荡培养至对数生长中期。离心收集菌体，用含10 mM MES和100 μM乙酰丁香酮的浸润缓冲液重悬。将两种细菌悬浮液按1:1体积比混合，并将最终OD600调整至0.5-0.8。将混合悬浮液在室温黑暗条件下孵育2-3小时后，用注射器注入约四周龄本生烟幼苗叶片的背面。20天后，对新生的幼叶进行RT-qPCR分析目标基因的转录水平。同时，以沉默目标基因的叶片为底盘，瞬时表达GFP蛋白并进行检测。
从本生烟中提取总RNA，用DNase I处理后，使用PrimeScript RT Master Mix反转录成cDNA。以此cDNA为模板，使用目标基因引物进行RT-qPCR。以NbActin基因（JQ256516.1）为内参，使用2-ΔΔCt法计算和分析数据。每个样品设置三个重复。
将pTRBO::GFP质粒导入根癌农杆菌GV3101菌株。在含相应抗生素的YEP固体培养基上于28°C培养48小时筛选阳性转化子。收集菌体并用浸润缓冲液重悬至最终OD600为0.5。将细菌悬浮液在室温黑暗条件下放置3小时后，用无菌注射器浸润四周龄本生烟植株叶片的背面。接种后，将植株置于25°C、16/8小时光/暗周期下培养。在指定时间点观察GFP荧光并采集叶片样本用于后续分析。
结果
N. benthamiana APs家族的鉴定与基本特征分析
共鉴定出129个候选AP序列。随后，通过NCBI-CDD（v3.20）和SMART验证，其中89个基因被确认包含完整的ASP结构域（PF00026）。利用蛋白分析工具对其理化性质进行分析显示，蛋白长度范围从232到666个氨基酸不等（最短：NbAP14/232 aa；最长：NbAP75/666 aa）。分子量范围从26,049.71到74,023.16 Da（最小：NbAP14/26.05 kDa；最大：NbAP75/74.02 kDa）。理论等电点（pI）跨度从4.57到9.52（最酸性：NbAP33/pI 4.57；最碱性：NbAP49/pI 9.52）。不稳定指数值范围从22.38到51.90（最稳定蛋白：NbAP17/22.38；最不稳定：NbAP44/51.90）。脂肪族指数范围从70.89到97.65（最低：NbAP47/70.89；最高：NbAP65/97.65）。总平均亲水性（GRAVY）范围从-0.330到0.268（最亲水：NbAP47/-0.324；最疏水：NbAP62/0.256）。此外，亚细胞定位预测显示主要区室为：液泡（25个成员，如NbAP1、NbAP15、NbAP20）和叶绿体（31个成员，如NbAP2、NbAP4、NbAP7）。胞外定位包括NbAP32、NbAP53、NbAP56、NbAP73。内质网定位包括NbAP30、NbAP38。质膜定位包括NbAP3、NbAP6、NbAP10等（14个成员）。细胞核定位包括NbAP35、NbAP45、NbAP58等（7个成员）。定位在液泡的成员（28%）可能参与重组蛋白降解（如NbAP16、NbAP23、NbAP54）；胞外定位的酶（如NbAP32、NbAP53）对分泌途径中的重组产物构成最高降解风险。本生烟AP家族成员在液泡（28%）和叶绿体（35%）中的富集，突显了它们在植物蛋白降解和胁迫响应中的重要作用。
系统发育分析
为阐明本生烟NbAPs的进化关系，本研究构建了包含拟南芥同源基因在内的系统发育树。本生烟NbAP基因家族可清晰地划分为三个主要分支：典型APs（A组）包含10个成员，均具有保守的植物特异性插入（PSI）结构域，且两个物种的同源基因（如NbAP72/AT4G04460）聚集在一起，表明功能保守。珠心蛋白样APs（B组）由39个成员（如NbAP89）组成，其特征是携带QCDYE和GCGYDQ半胱氨酸序列基序，并与拟南芥基因（如AT1G49050）形成一个独立分支。非典型APs（C组）是最大的分支（40个成员），根据结构差异进一步细分为三个亚组，其中C1成员最少（5个成员），其次是C2（14个成员），C3成员最多（21个成员）。在C3亚组中，基因NbAP27、NbAP64、NbAP88与拟南芥AT3G18490（ASPG1）紧密聚类，表明它们可能在种子休眠、活力和萌发中共享作用。在C2亚组中，NbAP24和NbAP42基因与拟南芥AT2G03200（ASPR1）紧密聚类，暗示它们在根发育中的重要功能。此外，我们观察到C3亚组中的NbAP29、NbAP36、NbAP37未与任何对应的拟南芥基因紧密聚类，表明这三个基因可能具有新功能。总体而言，系统发育树揭示了APs基因在物种间的进化保守性，而不同物种间APs的分化可能对应于多样的生物学功能。
保守基序、蛋白及基因结构分析
对89个NbAP基因的结构分析揭示了其外显子数量的显著多样性，范围从1到14个。非典型AP亚家族的外显子数量高度保守，范围为1到3个，C1亚家族的所有成员仅包含单个外显子且无内含子。相比之下，典型AP亚家族基因通常包含大量外显子（11-14个），例如NbAP12包含14个外显子，NbAP17包含11个外显子。同一亚家族内的基因具有相似的外显子数量，表明亚家族内功能相对保守。有趣的是，珠心蛋白样蛋白酶亚家族在外显子数量上表现出变异（1-13个），例如NbAP51包含1个外显子，而NbAP75包含13个外显子，暗示该亚家族成员潜在的功能多样性。
使用MEME软件在NbAP蛋白中鉴定出十个保守基序（基序1-10）。我们发现基序1、3、4、6和9在整个NbAP家族中普遍存在，表明这些基序在NbAP家族的保守功能中发挥作用。基序2在典型NbAP亚家族中分布较少（20%），仅在NbAP4和NbAP9的基因序列中发现。有趣的是，我们在典型NbAPs亚家族中未发现基序5和基序8，而这两个基序存在于其他亚家族中。相反，典型NbAP亚家族的成员特异性包含基序10，而该基序在所有其他亚家族中均缺失。可以推测基序10在典型AP家族基因的功能分化中起着重要作用。
基因复制与染色体分布分析
NbAP基因家族成员在本生烟的19条染色体上分布不均。染色体分布密度差异显著：其中Chr4和Chr17各包含10个基因，Chr8包含9个基因，Chr9包含8个基因，Chr3包含7个基因，Chr16包含6个基因，Chr1和Chr12各包含5个基因，而Chr2、Chr7和Chr11各包含4个基因。此外，Chr10、Chr13、Chr14、Chr15和Chr19各包含3个基因，而Chr5和Chr6仅包含单个基因。此外，我们发现一些NbAP成员以基因簇的形式存在于染色体上，例如NbAP80–86在17号染色体上成簇，这可能表明这些基因协同参与同一生物学过程。
片段复制是NbAP家族扩张的主要驱动力，促进了同一亚家族内功能相似基因的增加（例如，抗病相关基因的冗余备份）。我们鉴定了36个片段复制事件，涉及56个基因（约占家族成员总数的62.9%）。Ka/Ks比率是分子进化研究中用于推断作用于蛋白质编码基因的自然选择类型的关键指标。我们发现所有复制事件都发生在NbAP亚家族内部，表明亚家族内的特定基因扩张。然而，亚家族之间存在显著差异：典型AP亚家族包含8个复制事件，非典型AP亚家族包含18个，珠心蛋白样AP亚家族包含10个。NbAP13/NbAP18基因对的Ka/Ks值为0.75，表明某些位点可能经历了适应性进化，可能伴随着亚功能化或新功能化。
共线性分析
本生烟NbAP基因家族与其他物种的共线性分析揭示了显著的进化关系差异。在与番茄的比较中，63个基因成员显示出共线性，形成了85个共线性基因对，染色体位置相对保守。这种大规模保守性表明两个物种分化后基因组结构保持稳定，可能由于它们相对较近的系统发育关系（同属茄科），并暗示这些基因构成了参与重要生物学过程的核心功能模块。相比之下，本生烟与拟南芥之间的共线性明显较弱，仅30个基因形成了43个共线性基因对，且染色体位置保守性非常低。这一结果反映了茄科和十字花科植物在漫长的独立进化过程中经历了广泛的基因组重排，导致共线性片段破碎。
启动子顺式作用元件分析
在启动子区域共鉴定出20种类型的顺式作用元件，并将其分为三大功能类别：胁迫响应元件（包括WUN-motif、GC-motif、TC-rich repeats、LTR、ARE、MBS、W box、DRE core、STRE）、生长发育相关元件（MBSI、A-box、ABRE）和植物激素响应元件（as-1、AuxRR-core、CGTCA-motif、GARE-motif、P-box、TCA-element、TGACG-motif、TGA-element）。NbAP家族成员中存在多样化的顺式元件，表明它们可能参与与植物发育和环境响应相关的多种生物学功能。WUN-motif是植物基因启动子中重要的伤口诱导顺式作用元件，在机械损伤或病原体感染时特异性激活下游防御相关基因的表达。因此，我们推测含有该元件的NbAP成员可能在农杆菌瞬时感染本生烟过程中发挥作用。分析结果显示，NbAP27、NbAP58、NbAP24、NbAP48、NbAP82、NbAP80、NbAP84、NbAP21、NbAP52、NbAP25、NbAP60各自包含不少于3个WUN-motif，表明这些基因可能是农杆菌感染过程中的重要参与者。另一个数量较多的元件是STRE；例如，NbAP63的启动子包含11个，NbAP49包含10个，NbAP54包含8个，暗示了这些基因在胁迫响应中的潜在生物学功能。
农杆菌感染后NbAP家族成员的表达模式
为阐明NbAP家族在本生烟生物反应器中的作用，本研究利用公共转录组数据分析了农杆菌浸润后不同时间点（0小时、12小时、24小时、48小时、72小时）NbAP家族成员的动态表达。主要发现如下：观察到不同的时间响应特征。早期高响应基因包括NbAP7、NbAP36、NbAP53、NbAP49和NbAP22，它们在浸润后12小时被快速激活并维持相对较高的表达，表明它们参与早期抗病毒信号启动。持续激活基因包括NbAP46、NbAP47和NbAP79，其表达从0小时到72小时持续增加，反映了它们在感染过程中的重要功能。持续低表达基因包括NbAP60。为进一步验证这些结果，我们在农杆菌浸润12小时后收获的叶片上进行了RT-qPCR。结果证实NbAP46、NbAP47和NbAP79对农杆菌感染有显著响应。这些基因转录水平的变化为实验验证其在重组蛋白降解中的作用提供了候选基因。
通过VIGS验证NbAP家族成员参与重组蛋白稳定性
为研究NbAP基因在本生烟瞬
