《Cellular Oncology》：NR2F2/AGAP2 axis: regulating lipid synthesis to drive AML progression via AMPKα/ACC pathway
编辑推荐：
这篇研究性文章（非综述）系统揭示了AGAP2在急性髓系白血病（AML）中的致癌新机制。研究发现，转录因子NR2F2可直接结合并抑制AGAP2的转录。高表达的AGAP2通过抑制AMPKα/ACC信号通路，促进AML细胞的脂质沉积、增殖并抑制其分化和凋亡，从而驱动疾病进展。该工作阐明了一条全新的NR2F2/AGAP2/AMPK/ACC调控轴，为针对AML脂质代谢异常的治疗策略提供了潜在靶点。
1 引言
急性髓系白血病（AML）是一种起源于髓系造血干/祖细胞的恶性肿瘤，以骨髓中原始细胞的异常增殖和分化阻滞为特征。AML预后较差，老年患者的五年生存率仅为10%左右，因此迫切需要阐明其分子机制并确定新的治疗靶点。近年来，代谢重编程，特别是脂质和胆固醇代谢的失调，已被认为是AML的一个标志。胆固醇不仅是细胞膜的关键成分，也是各种信号分子的前体，其稳态对于白血病细胞的生存、增殖和分化阻滞至关重要。因此，靶向脂质代谢已成为一种有前景的新治疗策略。
ArfGAP with GTPase domain, ankyrin repeat, and PH domain 2 (AGAP2)，也称为PIKE-A，是一种GTP结合蛋白，可调节信号转导，影响细胞存活、凋亡、迁移以及脂质运输和代谢。其过表达促进脂质沉积和脂肪生成分化，并在多种癌症中高表达，促进肿瘤发生和进展。癌症基因组图谱（TCGA）和基因表达谱交互分析（GEPIA）的数据显示，AGAP2在AML患者中表达显著上调，且较高的AGAP2水平与较差的总生存期相关，表明其在该疾病中具有潜在的致癌作用。AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号通路在脂质代谢和自噬中起着重要作用。在AML中，AMPK信号通路的激活促进细胞分化并抑制增殖，突显了其作为治疗靶点的潜力。值得注意的是，有报道称AGAP2敲低可激活AMPK通路，促进脂肪酸氧化，并抑制脂质积累，从而改善小鼠的高脂血症。然而，AGAP2在AML中的具体功能和调节机制仍不清楚。
为研究AGAP2的上游调控机制，研究者利用JASPAR数据库进行了生物信息学筛选，预测核受体亚家族2 F组成员2（NR2F2）可直接结合到AGAP2基因的启动子区域。NR2F2是一种依赖于环境的转录调节因子，参与细胞生长、分化以及葡萄糖、胆固醇和脂肪酸的代谢，并在肿瘤发生中发挥复杂的、组织特异性的作用。基于此，研究者假设下调的核受体NR2F2可能转录调控致癌因子AGAP2，而AGAP2反过来可能参与AML的进展。本研究旨在通过实验验证这一调控轴，并阐明其对AML脂质代谢和白血病发生的功能影响。
2 材料与方法
本研究使用了来自AML患者和健康对照者的骨髓样本，所有程序均经中国医科大学盛京医院医学伦理委员会批准。从骨髓中分离CD34+细胞，并使用KG-1、HL-60等多种AML细胞系进行培养。通过慢病毒转导实现AGAP2和NR2F2的敲低或过表达。功能检测包括集落形成、CCK-8检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡和分化标志物CD11b、Giemsa染色观察形态、Filipin III染色检测游离胆固醇、油红O染色检测脂质沉积等。通过mRNA测序和KEGG通路分析筛选相关信号通路。通过Western blot检测AGAP2、NR2F2、p-AMPKα、AMPKα、p-ACC、ACC等蛋白表达。通过双荧光素酶报告基因实验、染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR和DNA pull-down实验验证NR2F2对AGAP2的转录调控。通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行脂质组学分析。通过皮下异种移植模型和尾静脉注射白血病模型评估AGAP2在体内的肿瘤生长和AML发展中的作用。
3 结果
3.1 AGAP2在AML CD34+细胞和AML细胞系中高表达
生物信息学筛选结合GO术语“脂质激酶活性调节”和AML中上调基因的交集，将AGAP2确定为候选基因。与正常患者相比，AGAP2在AML患者中表达上调，且高AGAP2水平与AML患者较差的总生存期相关。在98例初治AML患者的CD34+细胞中，AGAP2表达显著高于36例健康供体。值得注意的是，AGAP2在细胞遗传学高危组中的表达显著高于预后良好组和中危组。此外，AGAP2在多种AML细胞系中表达上调，其中KG-1细胞表达最高，HL-60细胞表达最低。AGAP2敲低后的mRNA测序显示，差异表达基因（DEGs）显著富集于细胞周期负调控、细胞周期检查点信号、脂质储存和脂质输入等生物过程，促凋亡基因表达增加，细胞周期相关基因发生改变。
3.2 AGAP2促进AML细胞增殖并抑制凋亡
在KG-1和HL-60细胞中，AGAP2过表达增加了集落形成能力和细胞活力，而敲低AGAP2则损害了这些过程。AGAP2敲低导致细胞凋亡率和台盼蓝阳性细胞比例显著增加。此外，AGAP2敲低诱导了KG-1和HL-60细胞的分化，从而缓解了AML特有的分化阻滞。
3.3 AGAP2敲低激活AML中的AMPK/ACC信号
KEGG分析显示，AGAP2敲低导致的DEGs显著富集于细胞周期、p53信号通路、AMPK信号通路和脂肪酸生物合成等关键通路。Western blot分析发现，AGAP2过表达降低了AMPKα磷酸化水平，而敲低AGAP2则增加了AMPKα磷酸化水平。AGAP2过表达显著降低了ACC的磷酸化水平，而敲低AGAP2则显著增加了ACC磷酸化水平，表明AGAP2对AMPK/ACC轴具有抑制作用。
使用选择性AMPK激动剂GSK621处理可逆转AGAP2过表达的影响。GSK621处理提高了AMPKα和ACC的磷酸化水平，逆转了AGAP2过表达引起的细胞活力增加，并提高了细胞凋亡率。同时敲低AMPKα则可减弱AGAP2敲低诱导的细胞凋亡增加。这些实验表明AMPK是AGAP2调节AML细胞凋亡的关键下游效应器。此外，GSK621处理恢复了AGAP2过表达诱导的成熟阻滞，增加了AGAP2过表达细胞中分化标志物CD11b的表达，而同时敲低AMPKα则降低了AGAP2敲低导致的CD11b水平升高。这些结果表明，AGAP2主要通过抑制AMPK活性来抑制髓系分化。
3.4 AGAP2促进AML中的脂质积累
转录组分析显示，AGAP2敲低抑制了关键脂质合成基因SREBF1和SREBF2的表达。非靶向脂质组学分析表明，AGAP2敲低显著降低了磷脂酸（PA）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和甘油三酯（TG）的水平。这些改变的代谢物显著富集于甘油磷脂代谢、脂肪消化吸收、甘油脂代谢、鞘脂代谢和胆固醇代谢等通路。Filipin III染色显示，AGAP2过表达降低了游离胆固醇水平，而其敲低则增加了游离胆固醇水平。油红O染色显示，AGAP2过表达促进了KG-1和HL-60细胞中的脂质沉积，而AGAP2敲低则减少了脂质沉积。
由于AMPK/ACC通路在调节脂质代谢中起着关键作用，研究者进一步探究AGAP2是否通过AMPK调节AML中的脂质代谢。Filipin III染色显示，AMPK激动剂GSK621处理显著降低了AGAP2过表达细胞中的游离胆固醇水平。同样，油红O染色显示，AGAP2过表达诱导的脂质沉积增加可被GSK621逆转。此外，AGAP2敲低引起的脂质沉积减少可被同时敲低AMPKα部分挽救。这些结果证明，AGAP2主要通过抑制AMPK活性来促进AML细胞中的脂质积累。
3.5 AGAP2敲低抑制肿瘤生长并抑制AML发展
在皮下异种移植模型中，AGAP2敲低显著抑制了肿瘤进展，导致肿瘤最终体积和重量减小。肿瘤组织分析证实了AGAP2的有效沉默，免疫组化显示细胞增殖（Ki67）减少，而Filipin III染色显示游离胆固醇水平升高。在尾静脉注射系统白血病模型中，AGAP2敲低导致小鼠体重增加，并在两个独立模型中均赋予了显著的生存优势（KG-1模型：中位生存期从5.0周延长至6.0周，风险比HR=0.226；HL-60模型：从4.5周延长至6.0周，HR=0.196）。对白血病负荷的评估显示，与对照组相比，shAGAP2组骨髓中CD45+细胞的比例较低，Wright-Giemsa染色也显示AGAP2敲低显著减少了骨髓中的原始细胞浸润。这些体内数据表明，AGAP2敲低有效抑制了白血病进展，并减轻了肿瘤负荷。
3.6 NR2F2通过抑制AGAP2表达来抑制AML进展
为确定AGAP2的潜在上游调节因子，研究者从GTRD和ChIP-Atlas数据库获得了预测结合AGAP2启动子的转录因子列表，并与AML中差异表达的基因取交集，得到五个候选调节因子。基于文献回顾和JASPAR分析，选择NR2F2作为AGAP2的推定转录调节因子进行进一步研究。GEPIA分析证实NR2F2在AML中表达下调，KM-plotter分析显示NR2F2高表达与AML患者较好的总生存期相关。Western blot分析显示，与正常CD34+细胞相比，NR2F2在CD34+AML细胞中的蛋白表达显著降低。功能实验发现，NR2F2过表达下调了AGAP2表达，而其敲低则上调了AGAP2表达。
为确定这种调控是否发生在转录水平，进行了双荧光素酶报告基因实验。构建了四个不同长度的AGAP2启动子片段。NR2F2显著并可比地抑制了所有四个片段的转录活性，表明关键调控区域可能位于-451 ~ +15区间内。通过ChIP-qPCR进一步绘制结合位点，使用针对该区域内三个潜在序列的引物，发现AGAP2启动子在第一组和第二组引物处有显著富集，其中第一组富集度最高。该区域包含两个预测的NR2F2结合基序（-411 ~ -405和-508 ~ -502）。使用覆盖-411至-405位点的探针进行的体外DNA pull-down实验进一步证实了NR2F2与该特定基序的直接物理相互作用。功能验证显示，在该位点引入互补突变后，NR2F2介导的转录抑制显著减弱。这些结果共同证明，NR2F2通过直接结合其启动子区域的-411至-405位点来转录抑制AGAP2。
此外，研究探究了AGAP2是否介导NR2F2的肿瘤抑制功能。NR2F2过表达抑制了AML细胞活力，而同时过表达AGAP2可抵消此效应。同样，台盼蓝染色评估细胞死亡显示，NR2F2诱导了显著的细胞毒性（染料阳性细胞增加），而AGAP2过表达有效挽救了此表型。NR2F2也促进了细胞凋亡，同样在AGAP2过表达后逆转。除生存和死亡外，NR2F2过表达促进了KG-1和HL-60细胞的髓系分化，并提高了游离胆固醇水平。相反，油红O染色显示，NR2F2减少了KG-1和HL-60细胞中的脂质积累，而AGAP2过表达抵消了此效应。因此，AGAP2过表达抵消了NR2F2在活力、凋亡、分化和脂质代谢方面的抗白血病作用。
4 讨论
本研究证明AGAP2在AML中高表达。细胞遗传学预后良好组和中危组患者的AGAP2表达显著低于高危组，表明高AGAP2表达可能与不良预后相关。功能上，AGAP2过表达促进AML细胞增殖并减少凋亡，而其敲低则在体内抑制肿瘤生长和细胞分化。这些表型与转录组分析结果一致。mRNA-seq分析显示，AGAP2敲低富集了与凋亡、细胞周期和脂质代谢相关的DEGs。这些差异表达基因也富集于p53、NF-κB和TNF信号通路，表明AGAP2的功能可能超出代谢调控，影响细胞应激反应和炎症微环境信号。
癌细胞改变脂质代谢以满足快速增殖的能量需求。增强的脂肪酸合成提供能量和大分子构建模块，这是许多癌症的标志。AML细胞比正常细胞需要更高的胆固醇水平，这促进了增殖、存活和耐药性。调节胆固醇代谢，促进其代谢或抑制合成，可诱导AML细胞发生致死性自噬。本研究证实AGAP2是AML脂质代谢的关键调节因子。AGAP2表达改变显著调节脂质稳态：过表达降低游离胆固醇并促进脂质沉积，而敲低则逆转这些表型。非靶向脂质组学发现了关键通路的广泛改变，为AGAP2在调节脂质代谢网络中的核心作用提供了系统范围的证据。
在机制层面，AMPK通路是细胞能量和脂质稳态的核心调节器。AMPK激活促进脂肪酸进入线粒体进行β-氧化，降低游离脂肪酸水平，并抑制脂肪生成。本研究证明，AGAP2通过抑制AMPK/ACC信号轴的磷酸化来驱动脂质沉积。AGAP2抑制AMPK活性，导致其下游靶点ACC的磷酸化减少，从而促进脂肪酸合成并最终驱动脂质积累。使用特异性AMPK激动剂GSK621处理完全逆转了AGAP2过表达诱导的脂质表型，证实了该通路的核心作用。因此，AGAP2作用于AMPK上游，抑制其活性，从而释放对脂肪生成的抑制，促进脂质合成和积累。
本研究采用两种不同的体内模型来研究AGAP2在AML进展中的作用。在皮下异种移植模型中，AGAP2敲低显著抑制肿瘤生长。在尾静脉注射系统疾病模型中，AGAP2敲低改善了生存率和体重，而其过表达则增强了骨髓中人CD45+细胞的负荷并缩短了生存期，表明AGAP2在体内起着促进AML进展的作用。
此外，研究揭示了AGAP2的上游转录调控机制。核受体NR2F2可直接结合AGAP2启动子并抑制其转录。NR2F2在AML患者的骨髓中表达下调，其过表达可诱导凋亡、促进分化、增加游离胆固醇水平并减少脂质沉积，这些效应与AGAP2相反。重要的是，AGAP2过表达有效抵消了NR2F2介导的所有肿瘤抑制表型。这确立了NR2F2-AGAP2-AMPK轴作为一个从转录抑制到代谢执行的关键信号级联，阐明了NR2F2至少部分通过抑制AGAP2转录来发挥其抗白血病作用。
本研究存在一定局限性，为未来研究指明了方向。首先，虽然异种移植和尾静脉模型有力地证明了NR2F2的肿瘤抑制作用和AGAP2在体内的致癌功能，但它们并未完全重现人骨髓微环境中的关键相互作用。使用患者来源异种移植（PDX）等更具生理相关性的模型将显著增强这些发现的转化相关性。其次，关于AGAP2在脂质代谢中的机制作用，现有数据确定了其对脂质积累的必要性，但尚未阐明具体改变的生化步骤。第三，在分子水平上，AGAP2抑制AMPK激活的确切机制仍有待充分阐明。第四，本研究专注于线性的NR2F2-AGAP2-AMPK轴；NR2F2和AMPK是否参与不依赖于AGAP2的额外直接调控交叉对话，仍是一个有待未来研究的开放性问题。
总之，本研究系统性地确定了AML中一个新的调控轴NR2F2-AGAP2-AMPK。该轴将转录调控与代谢重编程紧密联系起来。具体而言，NR2F2的下调减轻了对AGAP2的抑制，导致AGAP2活性过高，随后抑制AMPK，最终驱动脂质合成、促进细胞增殖并抑制分化。该工作不仅描绘了AGAP2通过抑制AMPK来调节脂质代谢的核心机制，还表明AGAP2可能作为协调更广泛细胞过程的枢纽。未来研究应进一步剖析AGAP2如何整合代谢、应激和炎症信号，同时探索靶向该轴内节点的治疗潜力。
