《Frontiers in Immunology》：Modulation of IRF7-driven transcription as a strategy to control HIV-1 latency
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本综述聚焦于HIV-1功能治愈的“阻断与锁定”（block and lock）策略，创新性地提出了通过调控干扰素调节因子7（IRF7）的转录活性来深度沉默病毒基因表达的思路。文章重点阐述了JAK2抑制剂帕克替尼（pacritinib）作为一种新型潜伏促进剂（LPA），通过下调IRF7有效抑制HIV-1的再激活而不引发免疫激活，为靶向IRF7以实现HIV-1转录的持久沉默提供了有力的实验依据和新颖的治疗视角。
JAK2抑制剂帕克替尼是一种强效的潜伏促进剂
基于以往关于JAK2抑制剂（JAK2i）具有潜伏调节特性的研究，本研究评估了JAK2抑制剂帕克替尼（pacritinib）作为潜伏促进剂（LPA）的能力。在淋巴J-HIG潜伏模型中，用PMA或伏立诺他（vorinostat）刺激后，通过测量GFP表达来评估潜伏的HIV-1前病毒的再激活。单剂量帕克替尼（1 μM）预处理可有效阻断由PMA和伏立诺他诱导的前病毒再激活，表现为GFP+细胞群减少且无细胞毒性。在帕克替尼处理的未刺激细胞中未观察到显著效应。
研究进一步在髓系非克隆潜伏模型（HL-HIG）中确定了帕克替尼的抑制效果，因为除了CD4+T细胞，单核/巨噬细胞系的细胞也可能是HIV-1潜伏库的另一来源。与在J-HIG中类似，帕克替尼处理显著阻断了伏立诺他在HL-HIG模型中诱导的HIV-1潜伏逆转，并且在PMA诱导后也显示出类似的抑制趋势。有趣的是，帕克替尼还对髓系细胞中自发的HIV-1潜伏逆转显示出抑制作用。此外，在J-HIG和HL-HIG模型中，对帕克替尼单独使用以及与PMA和伏立诺他联用的扩展剂量反应测试表明，帕克替尼能清晰且呈剂量依赖性地抑制这些潜伏逆转剂（LRA）诱导的HIV-1再激活。为了进一步评估帕克替尼作为LPA的活性，研究人员在其他非克隆淋巴（MOLT-HIG）、髓系（U-HIG）模型以及淋巴克隆模型（J-Lat clone 8.4）中将其与伏立诺他联用。在所有模型中，帕克替尼均显著阻断了伏立诺他诱导的潜伏逆转。
为了在离体（ex vivo）条件下评估帕克替尼的潜伏促进能力，从三位接受抗逆转录病毒治疗（ART）的HIV感染者（PWH）体内分离出静息CD4+T细胞，并用帕克替尼单独或与PMA和离子霉素（PMAi）联合处理。通过超灵敏巢式qPCR测量培养上清中的病毒RNA水平。与体外（in vitro）结果一致，帕克替尼处理在所有测试的三位受试者中都阻断了PMAi诱导的HIV-1潜伏逆转，其效果与非克隆体外细胞系模型中观察到的相当。此外，当在未刺激的CD4+T细胞中检测到自发的HIV-1再激活时，帕克替尼作为单一药物也能有效阻断这种再激活。计算了所有重复的布利斯独立指数（Δfaxy）以定量评估帕克替尼和PMAi之间的相互作用。根据该模型，负分表明组合具有拮抗作用，进一步证实了JAK2抑制剂帕克替尼的LPA活性。
理想的LPA应在不诱导不必要的全局T细胞激活的情况下阻断HIV转录，因为T细胞激活可能导致潜伏感染的CD4+T细胞克隆扩增，从而促进HIV疾病进展。为了评估帕克替尼处理是否影响CD4+T细胞的激活，从七名ART抑制的HIV感染者体内分离出原代CD4+T细胞，并在离体条件下用帕克替尼或作为免疫激活阳性对照的PMAi处理。在处理后72小时通过流式细胞术评估早期和晚期免疫激活的标志物。与PMAi相反，离体帕克替尼处理并未诱导CD4+T细胞的免疫激活，通过早期激活标志物CD69+和晚期激活标志物CD25+、HLA-DR+的频率测量。事实上，与未刺激条件相比，观察到CD25+CD4+T细胞群的频率显著降低。
总之，这些结果表明JAK2i帕克替尼作为一种LPA，可在多种类型的库细胞中抑制HIV-1再激活，且不诱导免疫激活。
帕克替尼通过下调IRF7表达发挥其LPA活性
为了进一步阐明帕克替尼LPA能力的潜在机制，研究人员对用PMA、非德拉替尼（fedratinib）和帕克替尼处理的HL-HIG模型进行了全转录组分析。对差异表达基因（DEG）的计算分析显示，与未处理的对照组相比，帕克替尼处理的细胞遗传变化极小，这与潜伏逆转剂（LRA）处理的条件形成鲜明对比。先前的研究表明，JAK2i非德拉替尼通过干扰素非依赖性的干扰素调节因子7（IRF7）激活机制发挥其LRA活性。此外，IRF7表达诱导与JAK2i的潜伏逆转能力呈正相关。接着，研究人员使用Qiagen的IPA软件分析DEG数据，以可视化或预测IRF7对RNA病毒反应的标志基因的激活状态及其对先天免疫反应和HIV-1复制的影响。在帕克替尼处理条件下，与PMA和非德拉替尼条件相比，大多数基因被有效下调或预测为下调。
接下来，研究人员进行了更详细的通路评估，以深入了解帕克替尼发挥潜伏促进活性的机制。通过蛋白质印迹（Western Blot）检查JAK-STAT相关基因的表达表明，帕克替尼处理导致pJAK2和pSTAT1蛋白水平轻微下降，同时IRF7在蛋白和转录水平上均呈现显著的剂量依赖性降低。IRF7表达水平与JAK2抑制剂以及其他常见潜伏逆转剂（LRA）诱导的HIV潜伏再激活能力呈正相关。LRA非德拉替尼以剂量依赖的方式诱导HIV潜伏逆转以及HL-HIG细胞中IRF7 mRNA的上调。因此，研究人员进一步评估了帕克替尼对HIV-1潜伏逆转的阻断与IRF7下调之间的关系。观察到在单独或联合使用潜伏逆转剂PMA和非德拉替尼处理的细胞中，IRF7在蛋白和mRNA水平均发生上调，这与预期一致。相反，当潜伏促进剂（LPA）帕克替尼与这些潜伏逆转剂（LRA）联合使用时，它抵消了IRF7的上调。此外，IRF7的调节与测试化合物（无论是单独使用还是联合使用）的潜伏逆转能力直接相关，在淋巴J-HIG模型中显著相关，在髓系HL-HIG模型中也呈现类似趋势。总的来说，研究数据一致支持IRF7依赖的机制是淋巴和髓系细胞模型中HIV潜伏的基础。
此前有研究提示，IRF家族成员能够激活HIV-1长末端重复序列（LTR）的转录。事实上，先前的研究已表明IRF7表达水平与Tat介导的反式激活显著相关。为了进一步探索帕克替尼作为HIV LTR反式激活调节剂的作用，研究人员进行了反式激活实验。TZM-bl细胞（其整合了由HIV-1 LTR控制的荧光素酶报告基因）用IRF7表达质粒转染，并用潜伏逆转剂（LRA）伏立诺他和非德拉替尼以及帕克替尼处理。在未转染的细胞中，用伏立诺他和非德拉替尼处理导致荧光素酶表达显著增加，而帕克替尼处理未引起LTR的反式激活。重要的是，当过表达IRF7时，在伏立诺他处理后，HIV-1 LTR的反式激活显著增强，帕克替尼处理也显示出类似的增强模式，非德拉替尼处理也遵循相似模式。这表明外源性IRF7过表达抵消了帕克替尼诱导的IRF7下调，而帕克替尼本身在TZM-bl细胞中不影响HIV-1 LTR的反式激活，因为该细胞在无刺激情况下基线LTR活性极低。总之，这些结果进一步证明了IRF7表达对HIV-1潜伏调节的直接作用，并表明LPA帕克替尼可能通过下调IRF7来抑制HIV潜伏逆转，这很可能是通过LTR转录阻断实现的。
帕克替尼选择性抑制由IRF7驱动的HIV-1多重剪接转录
为了研究IRF7和病毒LTR反式激活因子Tat之间潜在的直接相互作用，研究人员用编码FLAG-Tat和IRF7-HA融合蛋白的质粒瞬时共转染HEK293T细胞。分别使用FLAG特异性和HA特异性琼脂糖珠对Tat和IRF7进行独立的蛋白免疫共沉淀。有趣的是，IRF7与FLAG-Tat发生共沉淀，尽管相互作用程度中等，但在仅使用珠子作为对照时未观察到。相反，用抗HA珠子进行IRF7免疫沉淀导致了共沉淀Tat蛋白的检测，排除了非特异性结合。总之，这些结果表明Tat在培养细胞中与IRF7结合，进一步支持了IRF7作为HIV-1转录调节剂的作用。
然后，研究人员探究了帕克替尼在病毒转录之前和期间的作用。为此，通过qPCR定量了整合的前病毒DNA和病毒转录本的水平。用NL4-3 HIV-1毒株离体感染CD4+T细胞，分别在感染后18小时和48小时定量病毒整合以及病毒mRNA转录。正如预期，HIV-1逆转录抑制剂AZT和HIV整合抑制剂雷特格韦（ral）有效抑制了病毒整合以及通过扩增HIV-1多重剪接的tat-rev-nef转录本测量的病毒多重剪接转录本的转录。相比之下，帕克替尼处理对HIV-1整合周期影响很小，而在帕克替尼处理后观察到病毒多重剪接转录本明显减少。
综合来看，这些结果表明病毒蛋白Tat在培养细胞中与IRF7结合。它们也证明了帕克替尼在抑制HIV转录中的作用，很可能是通过下调IRF7实现的。
讨论
理解支持HIV-1转录的细胞和分子环境对于制定有效的根除策略至关重要。本研究中，研究人员在多种非克隆HIV-1潜伏体外模型中将选择性JAK2抑制剂帕克替尼鉴定为一种强效的潜伏促进剂（LPA）。尽管在不同模型中效力存在差异，但帕克替尼能一致地阻断潜伏逆转剂（LRA）诱导的HIV-1再激活，覆盖淋巴和髓系潜伏模型，以及来自ART抑制个体的离体CD4+T细胞。重要的是，使用非克隆潜伏模型增强了研究结果的生理相关性，因为这些系统能更好地捕捉HIV库体内特征性的前病毒整合位点和转录状态的异质性，这反映在自发再激活基线水平的内在变异性中。值得注意的是，帕克替尼能有效沉默HIV-1转录而不引发免疫激活，这是旨在实现功能治愈（即在不完全根除的情况下长期沉默病毒库）的“阻断与锁定”策略的关键要求。
如今，尽管抗逆转录病毒疗法（ART）在抑制HIV复制方面取得了成功，但它并不能消除潜伏的病毒库，而病毒库仍然是慢性炎症、免疫功能障碍和潜在病毒反弹的持续来源。近年来，包括潜伏促进剂（LPA）、潜伏逆转剂（LRA）和基因编辑技术在内的多种策略被提出来沉默或根除这些库，并在临床前研究中取得了不同程度的成功。更重要的是，少数个体在接受干细胞移植后实现了持续缓解，被广泛认为是实现 sterilizing cure 的案例，表明完全病毒根除在生物学上是可能的。然而，将这些孤立案例转化为广泛适用的疗法仍然是一个重大挑战，尽管在这种情况下，像LPA这样的药理学方法可能为持久的HIV缓解提供一条可扩展且安全的途径。
研究结果表明，帕克替尼的效应与IRF7的下调有关，IRF7是一种先前与HIV潜伏逆转和先天免疫激活相关的转录因子。IRF7在I型干扰素（特别是IFN-α）的诱导中起核心作用。研究团队先前及其他研究的数据表明，IRF7表达与JAK2抑制剂和其他潜伏逆转剂（LRA）的潜伏逆转能力相关，并且其调节直接影响HIV-1 LTR的反式激活。虽然帕克替尼和非德拉替尼都是JAK2抑制剂，但它们对IRF7表达的调节不同，对HIV-1转录产生相反的影响。具体来说，非德拉替尼上调IRF7并促进HIV-1再激活，而帕克替尼下调IRF7，这与其潜伏促进（“阻断”）活性一致。在研究的模型中，IRF7表达与HIV-1转录活性呈正相关，其过表达即使在帕克替尼存在的情况下也能恢复LTR的反式激活，表明帕克替尼的LPA活性在机制上与IRF7抑制相关。
IRF7也被确定为HIV-1库的遗传修饰因子。一项全基因组关联研究显示，特定的IRF7变体与降低的HIV转录活性相关，表明宿主遗传对库大小和行为的影响。此外，观察到的IRF7与病毒反式激活因子Tat之间的相互作用进一步支持了IRF7在调节HIV-1转录中的直接作用，可能是通过影响Tat介导的病毒转录本延伸或剪接来实现的。与此模型一致，帕克替尼对IRF7表达的下调限制了IRF7用于有效Tat介导的反式激活的可用性，从而削弱了Tat驱动的HIV-1转录。另外，IRF7中的多态性已被证明会损害浆细胞样树突状细胞响应HIV-1产生IFN-α的能力，可能影响疾病进展。IRF7的罕见功能丧失突变也与对严重病毒感染的易感性增加有关，包括流感和COVID-19，突显了其在抗病毒防御中的关键作用。
转录组学和通路分析强化了这一机制，揭示了帕克替尼处理的细胞中基因表达变化极小，并且预测了IRF7相关的HIV-1潜伏再激活通路的下调。这些发现强化了IRF7是HIV潜伏关键调节因子的概念，并表明其药理学靶向可能为持久的转录沉默提供一条新途径。这些结果也与最近的报道一致，即帕克替尼抑制TLR8介导的对HIV-1 RNA的促炎反应，表明其具有更广泛的免疫调节效应。
与其他JAK抑制剂不同，研究表明帕克替尼选择性抑制HIV-1多重剪接转录本的转录，这些转录本是预测生产性感染的标志物。具体来说，鲁索替尼（ruxolitinib）通过阻断细胞因子诱导的STAT信号传导来减少病毒再激活，而非戈替尼（filgotinib）通过内含子保留损害HIV剪接。相比之下，帕克替尼通过抑制与后期转录阶段相关的HIV-1 tat/rev/nef多重剪接转录本来发挥其作用，这很可能是通过IRF7依赖的机制，强调了帕克替尼作为靶向潜伏促进剂的潜力。
综上所述，研究结果将帕克替尼定位为功能治愈策略的有前景候选药物。通过靶向IRF7，帕克替尼提供了一种新颖且选择性的方法来沉默HIV转录而不引发免疫激活。从这个意义上讲，“阻断与锁定”策略的一个限制是宿主体内复制能力的HIV基因组的持续存在，如果表观遗传或转录调节被破坏，则存在再激活的风险。目前，潜伏促进剂（LPA）需要持续给药以维持转录沉默。然而，LPA可以作为ART的有价值的辅助手段，通过靶向导致慢性免疫激活的完整和缺陷前病毒，从而可能减轻导致非艾滋病相关合并症发展的持续性免疫激活。诱导深度病毒休眠状态的概念（类似于内源性逆转录病毒的沉默）仍然是一个引人注目的方向，特别是如果首先通过潜伏逆转剂（LRA）消除更容易诱导的前病毒。未来的研究应探索其长期效应、与其他LPA和LRA的潜在协同作用。此外，评估帕克替尼在存在机制不同的LRA时是否仍保持潜伏促进活性及其在临床环境中的适用性也将非常重要。
