《Frontiers in Plant Science》：The PtDPL1/PtGAMYB-PtLEAFY module regulates pollen fertility and flowering time in Pinus tabuliformis
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本文报道了针叶树油松（Pinus tabuliformis）中赤霉素（GA）信号通路关键转录因子PtGAMYB的功能研究。研究发现PtGAMYB是核定位蛋白，在雄球花和花粉中特异性高表达，并作为GA-DELLA通路下游的关键因子参与调控雄性生殖发育。其异源表达会导致拟南芥开花延迟、花粉活力下降及结实受损，这些表型可通过外源GA4 + 7处理恢复。研究进一步揭示了PtGAMYB通过与PtDPL1蛋白互作，共同抑制下游成花关键基因PtLEAFY的转录，从而调控雄球花发育的新机制。本研究首次在针叶树中建立了PtDPL1/PtGAMYB-PtLEAFY调控网络，为理解裸子植物的生殖机制提供了新见解。
PtGAMYB的鉴定与生物信息学特征
研究从油松中鉴定到一个GAMYB家族转录因子基因PtGAMYB（GenBank: Pt5G01300.1）。该基因位于5号染色体，具有典型的三个外显子/两个内含子结构，其开放阅读框长1857 bp，编码一个由618个氨基酸组成的蛋白质，预测分子量为66.65 kDa，等电点为5.50。多序列比对显示，PtGAMYB在其N端含有保守的R2R3结构域，以及GAMYB蛋白特有的三个保守结构域Box1、Box2和Box3，表明其属于R2R3-MYB家族。进化分析表明，PtGAMYB与落叶松PkMYB33具有100%的序列一致性，并与拟南芥的生殖发育调节因子AtMYB33/65同源关系密切。启动子顺式作用元件分析在PtGAMYB上游2 kb区域内鉴定出包括CGTCA（茉莉酸甲酯响应）、LTR（低温响应）、MBS（干旱诱导）等在内的多种调控元件，提示其可能整合激素、环境和发育信号以协调生殖过程。
PtGAMYB的表达模式与亚细胞定位
转录组数据分析揭示了PtGAMYB在油松不同组织和发育阶段的特异性表达模式。在鉴定的46个GA代谢相关基因中，PtGAMYB是唯一在雄球花中特异性上调表达的基因。其表达量在雄球花发育过程中逐渐增加，并在成熟阶段达到高峰。组织特异性分析显示，PtGAMYB在雄球花和花粉中表达量最高，而在营养芽、雌球花、针叶和根中表达水平极低。荧光原位杂交（FISH）实验进一步证实，PtGAMYB的转录本特异性地富集在雄球花的小孢子和花粉粒中。亚细胞定位实验将PtGAMYB与绿色荧光蛋白（GFP）融合后在烟草叶片中瞬时表达，结果显示绿色荧光信号特异性地定位于细胞核内，表明PtGAMYB是一个核定位的转录因子。
PtGAMYB异源表达导致拟南芥开花延迟与花粉缺陷
为了探究PtGAMYB的生物学功能，研究团队构建了在拟南芥中组成型过表达PtGAMYB的转基因株系（PtGAMYB-OE）。表型观察发现，与野生型（Col-0）相比，PtGAMYB-OE植株在长日照（LD）条件下表现出显著的开花时间延迟，平均晚开花约4.1天。在花器官发育方面，PtGAMYB-OE植株在花发育第13阶段无法正常散粉。花粉活力检测显示，野生型花粉在8小时内的萌发率可达80%，而转基因株系的花粉萌发率极低（约4%），且花粉管生长受阻。扫描电镜观察揭示，PtGAMYB-OE植株的花粉形态异常，表现为花粉壁塌陷、结构变形；其花药也出现皱缩，即使能开裂，内部花粉也多形态异常。此外，转基因植株的角果长度变短，种子结实率降低。这些结果表明，PtGAMYB的异源过表达干扰了拟南芥的正常开花进程和花粉发育，导致雄性育性下降。
外源GA处理可恢复PtGAMYB过表达引起的表型
为了验证PtGAMYB是否参与GA信号通路，研究对PtGAMYB-OE植株进行了外源GA4 + 7处理。结果表明，在营养生长向生殖生长转换阶段施加GA4 + 7，可以完全或部分恢复PtGAMYB-OE植株延迟开花的表型，使其开花时间与野生型相当。更重要的是，GA处理显著挽救了转基因植株的花粉缺陷：花粉萌发率恢复至野生型水平；扫描电镜显示，经GA处理后的PtGAMYB-OE植株，其花粉形态和花药结构均恢复正常。这证明PtGAMYB的功能依赖于GA，其过表达引起的表型是由于干扰了内源GA信号所致，也说明GA通过PtGAMYB调控花粉发育的途径在针叶树中相对保守。
PtGAMYB直接抑制PtLEAFY的表达
在被子植物中，GAMYB通常作为上游激活因子促进成花关键基因LEAFY的表达。然而，在油松中，PtGAMYB与PtLEAFY的表达模式呈现负相关。研究推测PtGAMYB可能负调控PtLEAFY。酵母单杂交（Y1H）实验证明，PtGAMYB蛋白能够直接结合到PtLEAFY启动子的特定 motif（GTAACCAAA）上。进一步的烟草叶片瞬时表达双荧光素酶报告基因（LUC）实验显示，当共表达PtGAMYB效应载体和PtLEAFY启动子驱动的报告载体时，报告基因的荧光素酶活性显著低于对照，证实PtGAMYB对PtLEAFY的启动子具有转录抑制活性。这些结果确定了PtGAMYB是PtLEAFY的直接上游负调控因子。
PtDPL1与PtGAMYB互作并增强其对PtLEAFY的抑制
GA信号通路的核心是GA促进DELLA蛋白的降解，从而解除DELLA对下游因子（如GAMYB）的抑制。研究通过酵母双杂交（Y2H）筛选发现，油松的DELLA蛋白家族成员中，PtDPL1和PtDPL3能与PtGAMYB在酵母细胞内发生互作。进一步的双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）实验在植物体内验证了PtGAMYB与PtDPL1在细胞核内存在直接的蛋白-蛋白互作，而与PtDPL3的互作未在植物体内得到证实。功能上，双荧光素酶报告实验表明，PtDPL1本身对PtLEAFY启动子活性无显著影响，但当它与PtGAMYB共表达时，能显著增强PtGAMYB对PtLEAFY启动子的抑制效果。这揭示了一种新的调控机制：PtDPL1通过与PtGAMYB互作，形成了转录抑制复合体，协同加强对下游靶基因PtLEAFY的抑制。
总结：PtDPL1/PtGAMYB-PtLEAFY调控模块的提出
基于以上发现，本研究提出了一个调控油松雄性生殖发育的新模块。在油松中，赤霉素信号通过降解DELLA蛋白（如PtDPL1）来解除其对PtGAMYB的抑制。释放的PtGAMYB进入细胞核，但它并非激活而是直接结合并抑制成花整合基因PtLEAFY的转录。此外，PtDPL1蛋白还能与PtGAMYB发生物理互作，形成复合体，进一步增强对PtLEAFY的抑制效力。这个PtDPL1/PtGAMYB-PtLEAFY调控网络最终通过抑制PtLEAFY的表达，来调节雄球花的形成、花粉育性，并影响开花时间。该机制不同于已知的被子植物中GA-GAMYB激活LFY的正调控通路，可能是针叶树特有的一种生殖调控适应机制。这项研究首次在裸子植物中解析了以PtGAMYB为核心的GA信号网络，为理解针叶树独特的生殖生物学提供了重要的分子框架和新见解。
