《Transboundary and Emerging Diseases》：Brucella abortus Inhibits SIRT1 to Modulate Intracellular Survival and Autophagy in Macrophages
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本文揭示了一项关于布鲁氏菌与宿主免疫系统相互作用的创新性发现。研究发现，牛种布鲁氏流产菌(B. abortus)能够通过抑制宿主巨噬细胞中的SIRT1蛋白表达，进而调控FOXO1转录因子的乙酰化修饰及自噬相关蛋白（如LC3-II、p62、Atg7）的表达，损害溶酶体功能，最终促进其胞内生存与增殖。本研究不仅为理解布鲁氏菌的致病机制提供了新视角，而且指出SIRT1是治疗布鲁氏菌病（brucellosis）的一个潜在新型治疗靶点，具有重要的科学意义和临床应用价值。
引言
布鲁氏菌（Brucella）是一种革兰阴性兼性胞内寄生菌，可侵入并在宿主细胞内存活，导致慢性感染。由布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病（brucellosis）是一种重要的人兽共患病，对公共卫生和全球经济构成重大挑战。与其他细菌不同，布鲁氏菌缺乏经典的毒力因子，其致病力依赖于其入侵、存活和在宿主细胞内增殖的能力。现有研究认为，布鲁氏菌主要通过形成依赖IV型分泌系统的布鲁氏菌含空泡（BCVs）以限制与溶酶体融合、抑制宿主细胞凋亡、并逃避免疫监视以抑制免疫系统激活等策略，实现长期的胞内生存。
宿主细胞的自噬是清除胞内病原体的关键防御机制，但布鲁氏菌也进化出操纵、抑制或逃避自噬以促进胞内存活的策略。例如，布鲁氏菌效应蛋白VceA和BtpB参与抑制宿主细胞自噬。此外，自噬相关蛋白WIPI1、ATG9、ULK1和Beclin1对布鲁氏菌的胞内生存至关重要。
SIRT1蛋白是NAD+依赖的III类组蛋白去乙酰化酶家族成员，是宿主免疫和炎症反应的关键调节因子。作为一种营养和代谢传感器，SIRT1可对多种细胞蛋白（包括组蛋白和非组蛋白）进行去乙酰化修饰。SIRT1的激活可诱导PI3K-AKT-mTOR信号复合物，从而促进自噬。此外，SIRT1还能以NAD+依赖的方式对自噬相关蛋白Atg5、Atg7和Atg8进行去乙酰化。重要的是，SIRT1可通过对FOXO1转录因子去乙酰化，上调Rab7内吞蛋白的表达，从而调节自噬体-溶酶体融合。先前研究表明，SIRT1在幽门螺杆菌（H. pylori）和沙门氏菌（Salmonella）等病原菌感染中，对调节宿主自噬和胞内生存起着重要作用。
然而，在本文研究之前，布鲁氏菌与SIRT1之间的关联尚未被描述，SIRT1是否在布鲁氏菌诱导的自噬中起作用也属未知。本研究旨在探索牛种布鲁氏流产菌感染对巨噬细胞SIRT1表达的影响，并阐明SIRT1在调控布鲁氏菌胞内增殖、细胞自噬及溶酶体功能中的作用。
SIRT1调控布鲁氏菌在巨噬细胞内的增殖
研究表明，SIRT1对于多种细菌的胞内存活至关重要。为了探究SIRT1是否参与调控B. abortus的胞内增殖，研究人员检测了感染后RAW264.7巨噬细胞中SIRT1的表达水平。结果显示，在感染后48小时和72小时，SIRT1的表达显著下调。在骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）中也观察到了类似的现象。
接着，研究通过使用SIRT1激活剂白藜芦醇（resveratrol）来探究其功能。研究人员首先确定了在RAW264.7细胞中促进SIRT1表达的最佳白藜芦醇浓度为17.5 μM。用此浓度的白藜芦醇刺激SIRT1表达，可显著抑制B. abortus在感染后24、48和72小时内的胞内增殖。这些数据表明，B. abortus的胞内增殖受SIRT1的负向调控。
SIRT1调控布鲁氏菌感染巨噬细胞中FOXO1的乙酰化修饰
SIRT1是一种需要消耗NAD+才能发挥功能的III类组蛋白去乙酰化酶。为了评估感染是否通过影响宿主细胞NAD+水平来调节SIRT1活性，研究人员检测了感染过程中NAD+和NADH水平的变化。结果显示，B. abortus感染导致RAW264.7细胞内NAD+水平下降，NADH水平升高，NAD+/NADH比率显著降低。相比之下，在感染的同时用白藜芦醇处理的细胞，其细胞内NAD+水平显著升高，NADH浓度降低，NAD+:NADH比率也高于仅感染的细胞。
白藜芦醇是SIRT1的核心靶点。研究发现，白藜芦醇处理可显著降低B. abortus诱导的FOXO1乙酰化修饰。为了进一步验证SIRT1的作用，研究人员建立了两个稳定敲低SIRT1的RAW264.7细胞系。结果发现，敲低SIRT1促进了B. abortus介导的FOXO1乙酰化。这些结果共同表明，SIRT1负向调控布鲁氏菌感染诱导的FOXO1乙酰化。
布鲁氏菌调控巨噬细胞中自噬相关基因的表达
SIRT1是细胞自噬的关键调节因子。为了探究SIRT1是否参与B. abortus诱导的自噬，研究人员评估了感染后自噬相关蛋白的变化。Western Blot结果显示，感染后12和24小时，自噬标志物LC3-II的表达没有变化，但在感染后48和72小时显著增加。相反，p62的表达在感染后12、24、48和72小时均显著上调。免疫荧光显微镜的结果与Western Blot结果一致：感染后48小时，LC3-II和p62的荧光斑点均增加。
此外，qRT-PCR结果显示，感染后48小时，自噬标志物ATG5和ATG7的mRNA水平显著降低，而Beclin1的mRNA水平不变。Western Blot进一步显示，Atg7蛋白水平在感染后48小时显著下降，而Atg5蛋白水平没有变化。这些发现表明，B. abortus感染可调控RAW264.7巨噬细胞中自噬相关基因的表达。
SIRT1调控布鲁氏菌感染巨噬细胞中LC3-II、p62和Atg7的表达
为了评估SIRT1是否参与调节B. abortus感染细胞的自噬，研究人员检测了经白藜芦醇处理后RAW264.7细胞中LC3-II、p62和Atg7蛋白的水平。结果显示，白藜芦醇处理显著降低了B. abortus诱导的LC3-II和p62的积累，同时显著促进了Atg7的表达。
通过稳定敲低SIRT1的shRNA实验发现，敲低SIRT1促进了B. abortus诱导的LC3-II的显著积累，而p62水平保持不变。在未感染的RAW264.7细胞中，敲低SIRT1也显著促进了LC3-II和p62的积累，这与感染后48小时观察到的LC3-II和p62水平变化一致。此外，在B. abortus感染的SIRT1敲低RAW264.7细胞中过表达SIRT1，会上调LC3-II的蛋白表达并下调P62的表达。综上所述，这些结果证明SIRT1在调节B. abortus感染细胞的自噬中起着关键作用。
布鲁氏菌通过抑制宿主SIRT1损害巨噬细胞溶酶体功能
初步结果显示，感染后48小时LC3-II和p62的表达显著增加，而Atg7的表达下降。研究人员推测，这可能是由于自噬体与溶酶体融合受损，导致自噬体积累所致。这一猜想得到了单丹磺酰戊二胺（MDC）染色实验的验证：B. abortus感染后细胞内自噬体数量显著增加。这些发现表明，B. abortus可能诱导了巨噬细胞的自噬，但同时可能损害了溶酶体功能，从而促进了自噬体的积累。
随后的Western Blot结果显示，感染48小时后，关键溶酶体蛋白m-CTSB和m-CTSD的表达显著下降。因此，为了探究SIRT1是否参与调节巨噬细胞的溶酶体功能，研究人员检测了白藜芦醇处理后m-CTSB和m-CTSD的表达。结果显示，施用白藜芦醇缓解了感染介导的m-CTSB和m-CTSD表达的抑制。在B. abortus感染的SIRT1敲低RAW264.7细胞中过表达SIRT1，也会上调m-CTSB和m-CTSD的蛋白表达。总之，这些数据表明，B. abortus通过抑制SIRT1来损害巨噬细胞的溶酶体功能。
结论
本研究首次揭示了B. abortus感染巨噬细胞可下调SIRT1的表达。SIRT1负向调控B. abortus的胞内增殖。感染降低了巨噬细胞中的NAD+水平，但用白藜芦醇刺激SIRT1表达可减轻这种抑制作用。SIRT1负向调控B. abortus诱导的FOXO1转录因子的乙酰化修饰。此外，B. abortus感染促进了巨噬细胞中自噬标志物LC3-II和p62的增加，同时抑制了Atg7标志物的表达。相反，白藜芦醇处理降低了B. abortus诱导的LC3-II和p62表达，并促进了Atg7的表达，而敲低SIRT1则产生了相反的效果。同时，B. abortus感染通过抑制关键蛋白m-CTSB和m-CTSD，减少吞噬体-溶酶体融合，并促进吞噬体积累，从而损害溶酶体功能。白藜芦醇介导的SIRT1激活缓解了B. abortus诱导的m-CTSB和m-CTSD表达抑制。
总而言之，本研究的发现揭示了B. abortus通过SIRT1调控其胞内增殖和巨噬细胞溶酶体功能，从而导致自噬调节，这为布鲁氏菌病的治疗提供了一个新的治疗靶点。
