《Journal of Fish Diseases》：Development and Validation of a Viability RT-qPCR Assay for Detecting Infectious Spring Viraemia of Carp Virus (SVCV)
引言
鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus, SVCV）是一种具有高度传染性的病原体，属于弹状病毒科，其负义单链RNA基因组编码五种结构蛋白。基于糖蛋白（G）基因序列，SVCV可分为四个基因型。自20世纪70年代在欧洲首次分离以来，该病毒已传播至欧洲、亚洲和北美，可在易感鲤科鱼类（特别是幼鱼）中导致高达90%的死亡率，尤其在春季水温10°C–17°C时危害显著。由于其高传播性和经济影响，鲤春病毒血症（SVC）被世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health, WOAH）列为须通报疾病。
传统的SVC诊断方法包括常规PCR、测序、免疫组化、基于抗原的ELISA、间接荧光抗体试验（IFAT）以及细胞培养中的病毒分离。WOAH推荐将RT-PCR作为主要筛查工具，并通过接种易感细胞系（如EPC、FHM、GCO）观察细胞病变效应（Cytopathic-effect, CPE）和进行分子分析来确认。然而，PCR可能会扩增来自非感染性或已灭活病毒颗粒的核酸，从而可能高估感染性颗粒的存在风险。尽管细胞培养仍是可靠方法，但细胞系易感性差异、检测周期长、污染风险以及对设施的要求限制了其在快速诊断中的实用性。
活力RT-qPCR（Viability RT-qPCR, vqPCR）检测方法应运而生，旨在解决这些局限。该方法利用诸如碘化丙啶单叠氮化物（Propidium Monoazide, PMA）或溴化乙锭单叠氮化物（Ethidium Monoazide, EMA）等嵌入染料，这些染料仅能穿透膜或衣壳受损的（无活力/非感染性）目标。在光激活后，染料不可逆地结合到核酸上，从而阻止来自非活力目标的扩增。近年来，vqPCR已应用于水生病毒学，例如选择性检测感染性真鲷虹彩病毒和白色斑点综合征病毒，突显了其在区分水生宿主中活力与非活力病毒颗粒方面的潜力。
本研究首先开发并分析验证了一种用于检测SVCV的qPCR方法，确立了其作为分子诊断工具的灵敏度和特异性。在此基础上，优化了包括染料浓度和光激活时间在内的PMA处理参数，将检测方法改进为vqPCR。随后，使用细胞培养确认的感染性样品以及通过十二烷基硫酸钠（SDS）和热处理灭活的非感染性样品，评估了vqPCR方法的特异性和选择性。此外，还比较了vqPCR与qPCR在检测感染性颗粒方面的性能表现。最后，在实验室模拟条件下评估了该方法对淡水样品的适用性。
材料与方法
SVCV qPCR检测方法的开发
针对SVCV的特异性引物和探针基于糖蛋白（G）基因序列设计。设计时参考了从NCBI GenBank数据库检索的45条完整G基因序列，涵盖了基因型Ia-Id，以确保广泛的遗传覆盖。通过生物信息学工具验证了靶标特异性。qPCR反应在Taka Ra Thermal Cycler Dice Real-Time System III上进行，优化后的条件为：95°C 5分钟，然后进行45个循环的95°C 10秒和60°C 20秒。
将包含SVCV基因型Ia全长G基因的质粒DNA（pDNA）作为阳性对照，用于构建标准曲线。通过10倍系列稀释的pDNA（107至101拷贝/反应）建立标准曲线，并计算扩增效率（E）和线性（R2）。为评估分析灵敏度，使用2倍系列稀释的pDNA（1000至1.95拷贝/反应）进行24次重复qPCR反应，通过概率回归分析计算95%检测限（LoD95%）及其95%置信区间（CI），并据此确定Ct值的诊断截断值。通过用2倍和1倍LoD95%的质粒稀释液（分别为14和7拷贝/反应）在96次重复反应中进行验证。
分析特异性通过检测一系列其他水生病毒（如病毒性出血性败血症病毒VHSV、真鲷虹彩病毒RSIV等）和细菌（如哈维氏弧菌、杀鲑气单胞菌等）的核酸来评估交叉反应性。
感染性和灭活病毒的制备、RNA提取与细胞培养
使用EPC细胞培养SVCV（基因型Ia）。病毒滤液接种细胞单层，培养后收集上清作为病毒接种物。为制备灭活病毒，将病毒原液在75°C加热3分钟并用1% SDS处理，随后稀释以降低细胞毒性。使用商业试剂盒从感染性和灭活样品中提取病毒RNA。为验证感染性，将样品接种到EPC单层细胞上，监测7天内的CPE。
SVCV vqPCR检测方法的开发与优化
选择PMAxx和四氯化铂（PtCl4）作为候选核酸嵌入染料进行优化。用不同浓度的染料（有或无0.01% Triton X-100）处理感染性和灭活性SVCV悬浮液，PMAxx处理样品随后进行光激活。评估了不同浓度染料对信号抑制的影响。确定最佳染料浓度（25 μM PMAxx，不加Triton X-100）后，进一步优化了预处理时间（摇动10、20、30分钟）和光激活时间（10、20、30分钟）。最终优化的条件为：25 μM PMAxx，黑暗中摇动30分钟，随后光激活20分钟。通过比较有/无PMAxx处理的Ct值变化（ΔCt）来评估灭活病毒信号的抑制效率和感染性病毒的选择性检测。
vqPCR在定义感染比例混合样品中的分析性能
制备包含不同比例感染性SVCV（0%、1%、10%、30%、50%、70%、90%、99%、99.9%和100%）的病毒悬浮液，对每个比例的样品进行vqPCR和qPCR三重检测。同时，将每个样品接种到EPC细胞中，监测7天内的CPE发展。
qPCR和vqPCR检测方法的诊断学评估
从韩国Jincheon的水产养殖场采集了500尾鲤鱼。确认SVCV阴性后，取其中100尾鱼的肾脏和脾脏组织作为阴性对照。通过实验性感染150尾鲤鱼获得SVCV阳性样品，分别用106或104SVCV拷贝/鱼进行腹腔接种。在感染后不同时间点取样。
使用阴性对照组织和实验感染鱼的组织匀浆滤液，分别通过qPCR、vqPCR和细胞培养进行分析。qPCR的诊断性能以WOAH推荐的巢式PCR结果为参考标准进行评估，vqPCR的诊断性能则以EPC细胞培养（CPE观察）结果为参考标准进行评估，计算诊断灵敏度（DSe）和诊断特异性（DSp）。
重复性与实验室间重现性评估
使用三种浓度的SVCV（108、106和104拷贝/200 μL）评估vqPCR的重复性，在20天内每天进行两次实验，每次两个重复，以评估批内、批间和日间变异。根据CLSI指南确定重复性。
为评估重现性，将100份鱼组织样品（50份SVCV阳性和50份阴性）随机标记并分发给三个独立的研究机构。在每个机构，由一名研究人员独立进行实验，对样品分别进行qPCR、vqPCR（经PMAxx预处理）和EPC细胞CPE分析。完成后，比较三个实验室的Ct值和CPE结果。
vqPCR在环境淡水（实验室模拟）中的应用
将SVCV分别添加到高压灭菌淡水和经脱氯处理的自来水（用于实验室模拟的环境淡水）中，终浓度为1 × 108拷贝/mL。将接种的水样在4°C、15°C和25°C下孵育，在第0、1、4、7、10、14和30天取样。在每个时间点，收集样品并过滤，然后进行核酸提取。用qPCR和vqPCR分析处理后的样品，比较病毒载量随时间的变化。
结果
SVCV qPCR检测方法的开发
设计的引物和探针靶向SVCV的G基因，产物长度为170 bp。qPCR在60°C退火/延伸温度下表现出最佳扩增。标准曲线显示质粒拷贝数与Ct值呈线性相关（R2= 1.000），扩增效率为103.8%。分析灵敏度评估得出LoD95%为6.82 拷贝/反应（95% CI: 4.69–18.24）。诊断截断值定为39.38 Ct。在2×和1× LoD95%下的验证显示，14拷贝/反应的检测率为100%（96/96），7拷贝/反应的检测率为93.75%（90/96）。特异性测试表明，该方法与所测试的19种其他水生病原体无交叉反应。
SVCV vqPCR检测方法的开发与优化
评估了PMAxx和PtCl4对感染性和灭活SVCV检测的影响。对于感染性SVCV，在PMAxx浓度高达25 μM时扩增得以维持，而添加Triton X-100则在所有浓度下均抑制扩增。相反，对于灭活SVCV，在25、100和200 μM PMAxx下，或存在Triton X-100时在25、50和200 μM PMAxx下，扩增被有效抑制。然而，超过25 μM的PMAxx浓度或使用Triton X-100也会抑制感染性SVCV的检测。
对于PtCl4，当其单独使用浓度不超过500 μM，或与Triton X-100联用浓度不超过100 μM时，对感染性SVCV的扩增无影响。仅在浓度≥1000 μM时才观察到对灭活SVCV的抑制，但这些浓度（单独≥500 μM，或与Triton X-100联用≥250 μM）同样会抑制感染性SVCV的检测。与PMAxx相比，PtCl4在不抑制感染性颗粒的浓度范围内，对灭活病毒的选择性抑制能力较弱。
综合来看，25 μM PMAxx（不加Triton X-100）被确定为SVCV vqPCR的最佳预处理条件，因为它能最大程度地抑制来自灭活病毒的信号，同时保留对感染性颗粒的检测。因此，PtCl4被认为不适合此应用。进一步优化的预处理程序为：黑暗中200 rpm摇动孵育30分钟，随后光激活20分钟。
qPCR、vqPCR和CPE对感染性与灭活SVCV的比较检测
PMAxx处理的vqPCR显著降低了对灭活SVCV的检测。对于感染性SVCV，Ct值基本不变（ΔCt= 0.92），而灭活SVCV的Ct值大幅增加，平均ΔCt为11.74。在12个重复中，仅1个（8.3%）产生了可检测信号（Ct= 42.33），该值超出了诊断截断值，因此在PMAxx处理后被认为处于可靠检测范围之外。所有感染性SVCV样品在EPC细胞中均产生清晰的CPE，而接种灭活SVCV的细胞未观察到CPE。这些结果证实，vqPCR通过有效抑制来自灭活病毒的信号，能够选择性检测感染性SVCV。
vqPCR在不同感染比例混合样品中的性能
对含有不同比例感染性和灭活SVCV的混合物进行了vqPCR检测。在未使用PMAxx的qPCR中，Ct值不随感染性SVCV比例变化而呈现显著变化。相反，在使用PMAxx处理的vqPCR中，Ct值随着感染性病毒比例的降低而逐渐增加，在100%和10%感染性病毒之间ΔCt约为3.83。当感染性SVCV比例为0%时，Ct值超过诊断截断值。当感染性SVCV比例≤1%时，细胞培养中未观察到CPE，对应的vqPCR Ct值约为37.96。这些结果证实，vqPCR能够以依赖比例的方式可靠地区分感染性与非感染性颗粒，与细胞培养结果一致。
vqPCR检测方法的诊断学评估
与WOAH推荐的巢式PCR相比，新开发的SVCV qPCR在100份感染和100份非感染鱼样本中结果完全一致，显示出100%的诊断灵敏度（DSe）和诊断特异性（DSp）。
与EPC细胞培养相比，vqPCR的诊断性能也达到100% DSe和100% DSp。在100份阳性样本中，qPCR的平均Ct值为22.53 ± 4.01，vqPCR为22.69 ± 3.88，ΔCt为0.16 ± 0.40，两者无显著差异。在Ct值最高（36.61）的样本中观察到轻微的CPE（约60%细胞脱落）。因此，vqPCR相对于EPC细胞培养也实现了100%的DSe和DSp。
vqPCR检测方法的重复性
使用高、中、低三种病毒浓度评估了SVCV vqPCR的重复性。批内重复性的变异系数（CV）范围为0.01%至0.53%，批间重复性的CV范围为0.01%至0.03%，日间重复性的CV范围为0.01%至0.02%。最高变异出现在高浓度样本的批内测量中（0.53%），所有其他CV均低于0.1%。这表明SVCV vqPCR在广泛的模板浓度动态范围内具有优异的精密度和重复性。
vqPCR检测方法的实验室间重现性
三名技术人员（A–C）的独立评估显示，qPCR和vqPCR的结果高度一致。所有50份SVCV阳性样本均被两种方法正确识别，阴性样本中未出现假阳性。每位技术人员的qPCR和vqPCR平均Ct值具有可比性，无统计学显著差异。
技术人员间Ct值的两两比较显示，qPCR和vqPCR均具有极强的重现性。对于qPCR，所有配对（A–B、A–C、B–C）的一致性相关系数（CCC）均超过0.95，且Pearson相关性极显著。同样，vqPCR也产生了高于0.95的CCC值和显著的Pearson相关性，表明操作者间具有极佳的一致性。在两种检测中，Ct值紧密聚集在回归线附近并近似于一致性直线，表明操作者间的变异极小且无系统性偏差。
vqPCR检测方法在自然灭活病毒中的应用
在高压灭菌水中，无论温度如何，SVCV在长达14天内均可被检测到。在没有PMAxx的情况下，初始病毒载量约为106拷贝/mL，在第14天时，在4°C、15°C和25°C下仍保持在相近水平（105–106拷贝/mL），表明随时间变化不大。相比之下，经过PMAxx处理后，观察到病毒载量逐渐下降，尤其在较低温度下：在4°C和15°C下，到第14天时病毒载量分别降至约103和104拷贝/mL，而在25°C下，病毒在同一时期内降至检测限以下。
在环境淡水中，SVCV的存留具有明显的温度依赖性。在没有PMAxx的情况下，病毒载量逐渐下降，温度越高下降越快。在25°C下，SVCV在第14天降至检测限以下；在15°C下，水平保持在约104–105拷贝/mL；在4°C下，保持在约105–106拷贝/mL。经过PMAxx处理后，所有条件下的下降速度都加快了。在25°C下，病毒载量在第14天降至检测限以下。在15°C下，水平降至103拷贝/mL，而在4°C下，到实验结束时仍保持在103–104拷贝/mL。
讨论
虽然已有多种RT-qPCR方法被开发用于检测SVCV，但由于缺乏充分的实验室间验证和诊断可靠性，尚未有方法被WOAH正式认可。因此，开发符合WOAH标准的诊断方法仍然必要。本研究按照WOAH推荐的水生动物诊断测试手册指南，开发了一种qPCR方法，并进行了涵盖分析灵敏度（LoD）、分析特异性、诊断灵敏度、诊断特异性、重复性和实验室间重现性的完整分析和诊断验证（阶段1-3性能评估）。此外，通过整合核酸嵌入活力染料，建立了一种vqPCR方法，以区分感染性与非感染性病毒颗粒，其原理是选择性消除来自受损或无活力病毒颗粒的扩增信号。
本研究的qPCR方法靶向SVCV的糖蛋白（G）基因，该基因在不同地理分离株间存在序列变异，因此与流行病学调查相关。设计的扩增子长度为170 bp，考虑到了qPCR最佳扩增子范围（150–200 bp）。该方法显示了完美的线性（R2= 1.000）和103.8%的扩增效率，符合推荐的效率范围（95%–105%）。在vqPCR中，扩增子长度代表了扩增效率与区分感染性和非感染性颗粒能力（ΔCt）之间的权衡。基于先前研究和本研究数据，所使用的170 bp靶标是一个平衡的选择，在为低滴度样品提供足够灵敏度的同时，保持了vqPCR的区分能力。本研究开发的qPCR方法实现了6.82 拷贝/反应的LoD95%和39.38 循环的诊断截断值，灵敏度超过了先前报道的SVCV检测方法。对19种水生病原体的特异性测试显示无交叉反应，证实了高分析特异性，并最大限度地减少了假阳性检测。
由于vqPCR选择性扩增受完整包膜或衣壳保护的病毒基因组，因此适当的预处理步骤至关重要。本研究优化了基于衣壳完整性的灭活方案（使用1% SDS，75°C处理3分钟）。在所测试的试剂中，PMAxx最有效地抑制了来自灭活颗粒的扩增，同时保留了感染性病毒的信号；而PtCl4也会抑制感染性颗粒的检测，这与之前关于其毒性和应用局限性的担忧一致。Triton X-100同样会降低感染性颗粒的扩增。这些发现强调，vqPCR的基本操作原理强烈依赖于衣壳完整性，预处理试剂的物理化学性质和反应条件直接影响该方法区分感染性与非感染性病毒颗粒的能力。值得注意的是，PMAxx通过选择性结合受损衣壳并仅抑制来自非感染性颗粒的扩增，最有效地实现了其预期功能。相比之下，PtCl4和Triton X-100可能由于进一步破坏衣壳结构或产生非特异性细胞毒性或化学反应，而损害对感染性病毒颗粒的检测。
优化活力染料浓度、孵育时间和温度对vqPCR性能至关重要。最终的预处理方案（黑暗中摇动孵育30分钟，随后光激活20分钟）与先前关于肠道病毒和环境样品的研究一致。在此条件下，基于PMAxx的vqPCR显著降低了灭活SVCV的信号，同时几乎不影响对感染性颗粒的检测（ΔCt= 0.92）。在混合病毒样品中，Ct值随着感染性病毒比例的降低而成比例增加，在100%和10%感染性样品之间约有3.83个循环的偏移，这与10倍稀释的理论预期一致。在含有1%感染性SVCV的混合样品中，细胞培养中不再观察到CPE，而vqPCR在约37.96 Ct时仍能检测到信号。这表明细胞培养法的检测限接近此阈值，并意味着vqPCR能够检测到低于细胞培养灵敏度的极低水平的感染性颗粒。
与WOAH推荐的巢式PCR和EPC细胞培养法相比，qPCR和vqPCR均显示出100%的诊断灵敏度和特异性，证实了两种方法在确定感染状态方面的高可靠性。两种方法之间的ΔCt差异极小且无统计学显著性，清楚地表明PMAxx处理不会干扰对感染性病毒的检测。此外，在Ct值为36.61时观察到弱CPE，表明细胞培养法的检测限接近此阈值，并提示即使在Ct值较高的样品中也可能存在感染性病毒。因此，在检测限附近，仅凭qPCR可能无法可靠地判断感染性，而vqPCR为解决这种不确定性提供了一个有价值的补充工具。
vqPCR也显示出极佳的重复性和重现性。根据MIQE 2.0指南，批内CV值应低于15%，批间CV值应低于25%。在本研究中，即使在低模板浓度下，批内和批间CV也始终远低于这些阈值。高C
