三维软水凝胶诱导人间充质干细胞进入“深度”静止状态

《Advanced Healthcare Materials》：3D Soft Hydrogels Induce Human Mesenchymal Stem Cells “Deep” Quiescence

本研究报道了一种模拟骨髓微环境力学特性（<5 kPa）的RGD功能化三维海藻酸盐水凝胶，可有效诱导人间充质干细胞（hMSCs）进入细胞周期G1期停滞的深度静止状态，并上调静止相关标志物（EZH1、FoxO3、p27）。该静止表型为三维培养所特有，且不依赖RGD浓度或黏附基序的化学性质，可能与mTORC1下调相关。该研究为hMSCs细胞治疗提供了新的体外静止模型与分子机制见解。

　　

引言

成人干细胞（ASCs）分布于几乎所有哺乳动物组织中，对维持组织稳态至关重要。它们通常驻留在特定的微环境（niche）中，该微环境的生物物理和生化特性精密调控着细胞的增殖与静止平衡。然而，在体外二维（2D）组织培养板（如TCPS）上培养时，包括人间充质干细胞（hMSCs）在内的多种ASC会失去其分化能力和临床潜力。研究表明，二维培养的hMSCs不仅会改变其表型，还会在有限次数的倍增后进入衰老状态。因此，开发能够模拟体内三维（3D）微环境的人工培养体系，对于研究hMSCs维持其原始静止表型的能力至关重要。

材料与方法

本研究采用从一名22岁男性骨髓中分离的hMSCs。为诱导静止，设置了多种培养条件：在二维培养中，设置了含有10%胎牛血清（FBS）的对照组（CONTROL）、无血清的血清剥夺组（SERUM-DEPRIVED）以及血清再补充组（SERUM-REPLENISHED）。在三维培养中，主要使用了经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列功能化的海藻酸盐水凝胶。通过控制RGD肽的接枝量，制备了RGD低含量（RGD-low）和RGD高含量（RGD-high）两种水凝胶，其力学刚度（<5 kPa）模拟了骨髓的机械特性。此外，还使用了胶原（collagen）水凝胶作为化学性质不同的三维对照体系。通过流式细胞术、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色、实时定量PCR、蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光等多种技术，系统评估了hMSCs的增殖状态、细胞周期、基因和蛋白表达、多能性及长期存活能力。

结果

1. 血清剥夺诱导hMSCs静止

在二维培养中，血清剥夺可有效诱导hMSCs细胞周期停滞。与对照组（21.9 ± 5.7% EdU⁺细胞）相比，血清剥夺组几乎检测不到EdU⁺细胞（0.3 ± 0.3%），且Ki67增殖标志物染色为阴性。当重新补充血清后，细胞能够重新进入细胞周期（15.4 ± 4.7% EdU⁺细胞），并保留向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的多能性，但其成骨和软骨分化效率低于对照组。

2. 三维海藻酸-RGD低水凝胶诱导hMSCs静止

当hMSCs被包裹在三维海藻酸-RGD低水凝胶中培养时，即使在含有血清的条件下，也几乎不增殖（EdU染色阴性），表明三维微环境本身就能促进细胞周期停滞。从水凝胶中回收的hMSCs在二维扩增后，仍能高效地向三系分化，其多能性未受损害。

3. 三维海藻酸-RGD低水凝胶支持hMSCs长期静止

长达28天的培养显示，三维水凝胶中的hMSCs代谢活性显著低于二维对照组，并维持在一个较低的平台期，与静止细胞（G₀期）的低代谢特征一致。活/死染色证实细胞在长期培养中存活良好。增殖细胞（EdU⁺）主要出现在水凝胶外围，此处的细胞形态更接近铺展的二维形状，而水凝胶核心区的细胞则保持球形。相比之下，血清剥夺的二维培养最终导致代谢活性几乎为零和大量细胞死亡。

4. hMSCs在三维海藻酸-RGD低水凝胶中发生细胞周期阻滞并表达静止相关基因

基因表达分析显示，与二维对照组相比，三维水凝胶中的hMSCs其静止相关基因——叉头框蛋白O3（FoxO3）、zeste同源物1增强子（EZH1）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B（p27）——均显著上调。细胞周期分析进一步证实，三维水凝胶中的细胞大部分被阻滞在G₁期。此外，三维培养条件下的细胞凋亡（caspase 3/7活性）水平与二维对照组无显著差异，但显著低于血清剥夺组，说明三维诱导的静止不引发凋亡。

5. 排除诱导静止的物理化学参数

研究排除了几个潜在因素作为三维诱导静止的唯一驱动力：

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  缺氧：尽管三维水凝胶内部存在缺氧环境，但单独在二维缺氧（1% O₂）条件下培养hMSCs，其增殖并未受到显著影响。
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  刚度：将海藻酸盐浓度提高至使水凝胶刚度超过10 kPa，并未改变其诱导静止的效果。
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  化学性质与黏附配体密度：无论是在二维表面还是在三维封装条件下，化学性质不同的胶原水凝胶与RGD功能化的海藻酸盐水凝胶，在诱导细胞增殖减少或静止方面效果相似。提高RGD肽的浓度（RGD-high）也未能逆转静止表型。
  综上所述，hMSCs的静止表型是三维培养环境所特有的，且不依赖于具体的黏附配体化学性质、浓度或超出某个阈值后的基质刚度。

6. 三维水凝胶通过替代通路诱导hMSCs静止

蛋白质表达分析揭示了二维血清剥夺静止与三维水凝胶静止在分子机制上的关键差异：

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  在三维水凝胶（海藻酸-RGD低、海藻酸-RGD高、胶原）中，mTOR复合体1（mTORC1）的关键组分Raptor表达缺失，而mTORC2的组分Rictor表达不变。
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  下游信号分子磷酸化Akt（p-AKT T308）在三维条件下显著下调。
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  静止相关蛋白FoxO3和p27在三维条件下表达上调。p27蛋白在三维培养的细胞核中富集。
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  相比之下，二维血清剥夺静止的细胞中，视网膜母细胞瘤蛋白（RB1）表达，而p27不表达。
  这些结果表明，三维水凝胶通过下调mTORC1信号，激活FoxO3/p27通路，诱导了一种不同于血清剥夺的“深度”静止状态。抑制二维培养细胞的肌动球蛋白收缩力或黏着斑相关通路（使用Blebbistatin、Y27632、CCG-203971），并未重现三维水凝胶中的分子表达谱。

7. 三维海藻酸-RGD低水凝胶在体内诱导静止

在大鼠皮下植入模型中，封装了hMSCs的海藻酸-RGD低水凝胶被植入体内3周和6周。通过EdU标记和Y染色体标志物KDM5D染色区分宿主细胞与植入的hMSCs。结果显示，植入的hMSCs其增殖率（EdU⁺）显著低于侵入水凝胶的宿主细胞。此外，水凝胶内p27⁺细胞的比例在6周时高于3周。这表明，三维水凝胶在体内复杂环境中仍能在一定程度上维持hMSCs的静止状态。

讨论

本研究表明，模拟骨髓关键特性的三维软水凝胶能够诱导hMSCs进入一种可长期维持、不依赖血清剥夺的“深度”静止状态。这种静止状态伴随着巢蛋白（Nestin）的表达、经典静止基因（FoxO3, EZH1, p27）的上调，以及mTORC1信号的下调。与最终导致细胞死亡的血清剥夺静止不同，三维水凝胶环境支持细胞长期存活并保持完整的多能性。研究还发现，这种静止表型是三维环境本身赋予的，不依赖于特定的黏附配体化学性质或配体密度。该三维培养系统为在体外研究hMSCs静止的分子通路提供了一个优越的模型，并有望应用于其他类型的ASC，为开发更有效的干细胞治疗策略提供了新的见解和工具。