《Journal of Environmental Management》：Mechanistic insights into the stereoselective toxicity of chiral difenoconazole in HepG2 cells
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立体异构体 difenoconazole 在 HepG2 细胞中呈现显著毒性差异，(2S,4S) 和 (2R,4R) 对细胞活力抑制最强（44.58%），并诱导氧化应激、DNA 损伤及凋亡（24.45%），分子对接显示其与 ROS 和 SOD 蛋白结合能力最强。
张旭志|郭宇晨|王俊普|侯玉清|王兰军|李淑涵|程波|朱鲁生|王俊|金英模|王金华
中国山东省农业大学资源与环境学院，山东省农业大学生态环境重点实验室，土壤与肥料资源高效利用国家工程实验室，泰安，271018，中华人民共和国
摘要
二氟唑是一种三唑类杀菌剂，存在四种立体异构体形式：(2R,4R)、(2R,4S)、(2S,4R)和(2S,4S)-二氟唑。在HepG2细胞中观察到这些异构体之间的毒性存在显著差异。(2S,4S)-二氟唑异构体表现出最强的细胞毒性，在20 μg/mL浓度下细胞存活率降至44.58%，而(2S,4R)异构体的影响最弱（85.47%）。LDH释放和氧化应激标志物（ROS和MDA）显著增加，同时抗氧化酶活性（SOD和CAT）也升高，尤其是在暴露于(2S,4S)-和(2R,4R)-二氟唑的细胞中。(2S,4S)异构体还导致严重的DNA损伤、细胞周期停滞（G2/M期22.4%）和细胞凋亡（24.45%），而(2S,4R)-二氟唑的影响最小。转录组学和分子对接分析显示，(2S,4S)-二氟唑影响关键通路，包括p53信号通路、氧化磷酸化和细胞周期调控，并与ROS和SOD蛋白有强结合。本研究突出了二氟唑的立体选择性毒性，为手性农药的环境和健康风险提供了重要见解。
引言
随着创新农药的发展，越来越多的农药被发现具有手性（Zhang等人，2025年；Song等人，2017年）。据估计，全球使用的农药中约有30%是手性的，而且这一比例还在继续上升（Hu等人，2020年；Zhang等人，2019年）。手性异构体的不同空间构型通常导致不同的生物活性，其中一个对映体通常具有高活性，而其他对映体则活性较低甚至无活性（Meng等人，2022年；Valentová等人，2023年）。科学技术的进步改进了合成方法，使得某些手性农药能够以光学纯度高、活性高的对映体形式生产、注册、销售和应用。著名的例子包括S-甲基氯、甲氧氯（metalaxyl-M）、喹唑啉酮-P和草甘膦-P（Xu等人，2022年；Liang等人，2019年；Zhang等人，2021年）。实际上，农药应用通常只使用外消旋混合物或特定的立体异构体，而其他异构体则被丢弃或研究不足（Boros等人，2024年；Zhang等人，2022a）。例如，prothioconazole的R-对映体及其R-代谢产物的抗病原真菌效力分别比S-对映体高2.33倍和3.48倍——这表明R-prothioconazole比其S-对应物效力显著更强（Zhang等人，2019年）。这些考虑表明，任何关于手性农药的研究或风险评估都必须考虑立体异构体之间的差异（Tian等人，2023年；Hydbring等人，2016年）。
特别是三唑类杀菌剂在农业中得到广泛应用，因为它们具有广谱、高效和持久的效应（Fahy等人，2025年；Fan等人，2025年；Zhou等人，2016年）。值得注意的是，大约84%的三唑类杀菌剂是含有两种或更多立体异构体的手性化合物（Deng等人，2021年；Li等人，2020年），这些杀菌剂在环境残留物消散和代谢方面的立体选择性行为引起了越来越多的关注（Wang等人，2023年；Liu等人，2025年；Peng等人，2025年；Diao等人，2025年）。二氟唑就是一种广谱的1,2,4-三唑类杀菌剂（Li等人，2025b）；它含有两个不对称碳原子，因此存在四种立体异构体：(2R,4R)-、(2R,4S)-、(2S,4R)-和(2S,4S)-二氟唑。由于每种立体异构体具有不同的空间构型，二氟唑可能表现出立体选择性毒性（Song等人，2021年；Zhu等人，2025年）。
事实上，研究表明，二氟唑的各个立体异构体对目标生物的生物活性可能有所不同，尽管它们的相对效力各不相同，且没有一致的模式出现（Song等人，2021年；Wang等人，2024年）。此外，一种立体异构体可能迅速代谢为毒性较低或无毒的产品，而其他异构体代谢较慢，因此倾向于持续存在并表现出更高的毒性（Gu等人，2018年；Li等人，2025a）。例如，Chang报告称，在富士和汉富士苹果中，(2R,4R)-和(2R,4S)-二氟唑优先降解（Chang等人，2019年），而(2S,4S)-和(2S,4R)-二氟唑在果实中显著富集。同样，在土壤的有氧和厌氧条件下，(2R,4R)-和(2R,4S)-二氟唑也优先降解，导致(2S,4S)异构体相对富集，其环境毒性最高（Dong等人，2013年）。此外，毒理学评估表明，(2S,4S)-二氟唑对映体可引起严重的不良影响：它表现出明显更高的心脏毒性、潜在的致癌性以及对多种核受体的负面影响（Huang等人，2022年；Voiculescu等人，2022年）。这些发现强调了在评估二氟唑的环境和人类健康影响时考虑立体选择性毒性的重要性，并强调了加强相关研究以预测和预防潜在风险的必要性。
HepG2细胞常用于药物代谢研究，因为它们可以模拟人体肝脏的代谢过程，使其成为研究手性农药在人体内代谢特性的理想体外模型（Arzumanian等人，2021年；Huang等人，2025年；Chow等人，2023年；Bao等人，2022年）。Voiculescu进一步发现二氟唑可能与血浆蛋白结合，鉴于人类细胞色素P450酶在异生物质代谢中起核心作用，他们进行了分子对接研究以评估二氟唑立体异构体与这些代谢蛋白的相互作用（Paggi等人，2024年；Voiculescu等人，2022年；Wang等人，2021年）。尽管先前的研究已经报道了二氟唑的立体选择性环境和生物活性，但关于其在人源肝细胞中的细胞毒性效应的机制证据仍然有限。特别是，立体选择性氧化应激、DNA损伤和细胞凋亡反应的分子途径仍不甚清楚。因此，本研究系统地研究了HepG2细胞中二氟唑立体异构体的立体选择性细胞毒性，并结合了细胞测定、转录组学和分子对接来阐明潜在的毒性机制。
材料
外消旋二氟唑（rac-difenoconazole，纯度99.5%）和四种单独的二氟唑立体异构体（纯度≥98.0%）从上海秦路生物技术有限公司（中国上海）获得。二氟唑及其立体异构体溶解在二甲基亚砜（DMSO）中制备储备溶液，并用培养基稀释至所需浓度，所有组（包括对照组）的最终DMSO浓度保持在0.1%（v/v）以下。HepG2人肝细胞
二氟唑立体异构体对HepG2细胞的细胞毒性效应
为了评估二氟唑对HepG2细胞增殖的立体选择性效应，我们用外消旋二氟唑及其四种立体异构体——(2R,4R)-、(2R,4S)-、(2S,4R)-和(2S,4S)-二氟唑——在0、5、10和20 μg/mL浓度下处理细胞24小时。通过观察细胞形态、CCK-8测定和LDH释放来评估细胞毒性（图1）。在对照组中，细胞形态完整且粘附良好。随着二氟唑浓度的增加，所有处理组中的细胞
讨论
选择5、10和20 μg/mL的浓度是为了覆盖HepG2细胞中的低、中、高暴露范围，并与常用的体外研究三唑类杀菌剂细胞毒性和机制研究的浓度一致。这些浓度也有助于我们了解该化学物质在某些组织中积累时的作用方式（Serra等人，2023年；Wang等人，2021年；Zhang等人，2022b）。
细胞活力测定和LDH释放测量是评估
结论
通过整合来自细胞测定、氧化应激测量、流式细胞术、分子对接和人类肝癌HepG2细胞转录组分析的证据，本研究证实二氟唑在人类肝细胞模型中表现出显著的立体选择性细胞毒性。肝脏是异生物质代谢的关键器官，在HepG2细胞中观察到的差异性损伤表明，在现实的人类暴露情况下，这种手性化合物的不同立体异构体
CRediT作者贡献声明
张旭志：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，数据管理。郭宇晨：撰写——初稿，可视化，验证，数据管理。王俊普：可视化，验证，数据管理。侯玉清：研究，概念化。王兰军：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理，方法学，概念化。李淑涵：方法学，研究。程波：方法学，研究。朱鲁生：撰写——
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金[42477029, 42277039, 42207026]、山东省自然科学基金（ZR2022QD098）、山东省泰山学者专项基金以及山东省农业研究体系（SDARS, SDAIT-30）的支持。
