《Advanced Science》：A Testis-Specific Aralkylamine N-Acetyltransferase Regulates Dimorphic Sperm Function and Male Fertility in Moths
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本研究以草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）为模型，鉴定了一个鳞翅目昆虫保守的、睾丸特异性的芳烷基胺N-乙酰转移酶LTNAT。该基因对雄性生育力不可或缺，其敲除破坏有核正常精子（eupyrene）的线粒体衍生物结构，并严重削弱无核辅助精子（apyrene）的运动能力，最终导致雄性完全不育。多组学分析揭示了其通过调节能量代谢、脂质稳态和跨膜运输等通路发挥作用。该基因功能的保守性在其他蛾类中得到证实，使其成为极具潜力的害虫遗传防治新靶点。
鳞翅目昆虫睾丸特异性芳烷基胺N-乙酰转移酶调控双型精子功能与雄性不育
1 引言
在动物界，精子表现出惊人的形态多样性，是进化最快的细胞类型之一。一个雄性个体能在同一个睾丸中持续产生两种形态不同的精子，这种现象被称为精子二型性。通常，只有一种类型能够使卵子受精，称为“可育精子”或有核正常精子（eusperm/eupyrene），而另一种不具受精能力的类型称为“不育精子”或无核辅助精子（parasperm/apyrene）。精子二型性已在软体动物、环节动物、节肢动物和脊索动物等多个门类中被独立报道，表明这是一种在不同谱系中反复进化出的繁殖特征。
在鳞翅目昆虫中，精子二型性是雄性繁殖的一个显著特征。除了两种缺乏典型无核辅助精子的小翅蛾物种外，几乎所有鳞翅目雄性都会产生有核的正常精子和无核的辅助精子。尽管两种精子类型源自同一生殖细胞谱系，但它们在产生时间和所经历的减数分裂程序上存在显著差异。正常精子的发生通常在幼虫阶段开始，在化蛹后停止，而无核辅助精子的发生仅在化蛹前后启动。细胞学和生理学研究显示，从产生正常精子到产生无核辅助精子的转换受血淋巴中一种大分子因子的调节，该因子的可及性随发育阶段而变化，从而在生物体水平上对二分法的精子发生进行全局控制。
尽管无核辅助精子不能使卵子受精，但它们在鳞翅目昆虫的繁殖过程中扮演着关键的生理角色。家蚕（Bombyx mori）的遗传研究表明，Sex-lethal（Sxl）基因的突变会破坏无核辅助精子的运动能力，从而阻碍了有核正常精子从交配囊到受精囊的有效迁移。在多种交配的菜粉蝶（Pieris napi）中，无核辅助精子可以延迟雌性再次交配，从而可能降低雄性配子在后续精子竞争中被取代的风险。对鳞翅目模型家蚕精子发生的研究已获得重要见解：敲除Maelstrom（Mael）、蛋白精氨酸甲基转移酶5（Prmt5）或Vasa会导致两种精子类型的发育缺陷。此外，包括多胺调节因子1结合蛋白（PMFBP1）在内的几个基因，是正常精子发生和转移所特需的，表明双型精子受不同的遗传调控模块控制。尽管有这些进展，我们对调控鳞翅目昆虫双型精子发育的遗传基础的理解仍然有限。此外，许多高繁殖力的鳞翅目害虫对全球粮食生产构成严重威胁。因此，鉴定参与精子发生的关键基因也为害虫遗传控制提供了分子靶点。
草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是一种产生双型精子且已对多种化学杀虫剂产生抗性的鳞翅目害虫。本研究以草地贪夜蛾为模型，探究精子发生的分子基础。利用RNA-seq和CRISPR/Cas9技术，我们鉴定了一个雄性不育基因LOC118263478。结构预测、催化活性测定和系统发育分析共同表明，LOC118263478编码一个鳞翅目昆虫保守的、睾丸特异性的芳烷基胺N-乙酰转移酶，我们将其命名为LTNAT。
2 结果
2.1 睾丸转录组比较分析筛选睾丸特异性基因
为了探究二分法精子发生的分子基础，我们对1日龄雄成虫的睾丸、雄性附腺和雄虫躯干组织进行了转录组测序。样本相关性和主成分分析显示，睾丸与另外两种组织之间存在显著的基因表达差异。我们筛选出在两种比较中均显著上调的基因。从这些基因中，我们根据睾丸 vs 雄虫躯干比较中的表达倍数，选择了前五个上调的未注释基因进行功能探索，包括LOC118263478。转录组定量数据和RT-PCR分析均验证了这五个基因仅在睾丸中特异性表达。
2.2 CRISPR/Cas9介导的LOC118263478敲除导致雄性不育
为了检测五个睾丸特异性基因在雄性生育力中的潜在作用，我们使用CRISPR/Cas9技术产生了基因敲除突变体。我们成功获得了LOC118263478突变体（缺失92个碱基对）以及其他四个基因的突变体。单对交配实验评估了单基因敲除对雄性生育力的影响。结果显示，敲除LOC118263478会导致雄性完全不育，表现为与野生型雌性交配后，雌性产卵量显著减少，且卵孵化率为零。而其他基因的敲除对生育力有不同程度的影响或无影响。对LOC118263478突变体的全面评估表明，该突变不影响交配成功率和交配持续时间，但会显著减少与突变体雄虫交配的雌虫的产卵量。该基因以隐性方式发挥作用，其杂合突变不会损害雄性生育力。
2.3 LOC118263478对多胺和芳烷基胺具有催化活性的生化特征
为了解LOC118263478与雄性生育力的关系，我们首先对该蛋白进行了生物信息学分析。LOC118263478缺乏信号肽和跨膜结构域。AlphaFold结构预测显示，该蛋白由7个β-折叠和8个α-螺旋组成。结构比对发现，LOC118263478与果蝇（Drosophila melanogaster）的胍丁胺N-乙酰转移酶结构最相似。从N端到C端，LOC118263478包含四个连续的保守基序：基序C、D、A和B，这是昆虫aaNATs的典型特征。尽管有这些结构相似性，LOC118263478与已知的几种昆虫aaNATs的序列一致性很低。DTNB法测定Ni-NTA亲和富集的重组LOC118263478蛋白活性表明，该蛋白对四种多胺和三种芳烷基胺底物具有可测量的催化活性。
2.4 LOC118263478（LTNAT）调控雄性生育力的功能在蛾类中保守
tBLASTn和BLASTp分析显示，LOC118263478的同源物广泛分布于鳞翅目昆虫中，但在其他昆虫目的代表物种中不存在。多重序列比对显示，LOC118263478同源物在鳞翅目内高度保守。系统发育分析表明，来自同一亚科的同源物始终形成支持良好的单系群。RT-PCR证实了该基因同源物在另外两种蛾中也具有睾丸特异性表达模式。基于以上结果，我们初步将LOC118263478命名为“鳞翅目保守的睾丸特异性aaNAT”（Lepidoptera-conserved testis-specific aaNAT, LTNAT）。为评估LTNAT在雄性生育力中的功能保守性，我们使用CRISPR/Cas9技术敲除了二化螟（Chilo suppressalis）和甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）中的LTNAT同源物。单对交配实验表明，与对照组相比，G0代突变体雄虫显著降低了其雌性配偶的产卵量、卵孵化率和存活后代数量。这些结果表明，LTNAT调控雄性生育力的功能在蛾类中是保守的。
2.5 LTNAT调控有核正常精子发生和无核辅助精子运动力
为理解LTNAT缺失导致雄性不育的原因，我们检查了突变体雄虫的精子发育以及在雄性和雌性生殖道中的运输情况。对1日龄成虫精子的荧光染色显示，LTNAT破坏不影响正常精子束内细胞核的位置和排列，但与野生型平滑的尾部相比，突变体正常精子束的尾部出现了点状肿胀。而无核辅助精子束的形态在野生型和突变体之间没有区别。评估精子在雄性生殖道内的转移发现，无核辅助精子束已解离，而有核正常精子仍保持成束状态，且在其尾部表现出点状突起，表明精子向复射精管的初始转移是正常的。所有突变体的正常精子束都是异常的。在精子束早期伸长阶段未观察到点状肿胀，因此推断肿胀发生在正常精子束成熟的最后伸长阶段。
在交配过程中，精子和精液被转移到雌虫的交配囊，在那里正常精子束解离，无核辅助精子变得具有运动能力。运动的无核辅助精子随后协助有核正常精子从交配囊移动到受精囊。为评估此过程，我们在与突变体雄虫交配1小时后对交配囊中的精子进行了染色和计数。解离的有核正常精子鞭毛携带点状突起，且交配囊中有核正常精子的数量显著减少。对交配后24小时的受精囊分析显示，与野生型雄虫交配的雌虫受精囊中充满了精子，而与LTNAT突变体雄虫交配的雌虫受精囊则呈透明状且缺乏精子。我们假设此表型可能是由无核辅助精子运动能力下降引起的。视频显微镜记录从精荚中分离的无核辅助精子的运动情况证实，与野生型相比，突变体雄虫的无核辅助精子运动能力严重受损。此外，LTNAT信号在处女雌虫的交配囊、受精囊及精荚基质中均未检测到，且该蛋白缺乏信号肽，不在雄性附腺中表达。这些观察结果表明，LTNAT作为一种精子蛋白发挥作用，其缺失直接导致无核辅助精子功能缺陷。总之，我们的结果表明LTNAT对双型精子的功能至关重要。
2.6 LTNAT突变破坏有核正常精子线粒体衍生物的结构
为阐明LTNAT突变如何影响精子功能，我们首先通过免疫荧光检查了LTNAT在精子中的亚细胞定位。LTNAT定位于两种精子，在有核正常精子的鞭毛区域信号最强。在突变体精子中，特异的LTNAT信号几乎检测不到，证实了有效的基因敲除。扫描电镜分析显示，突变体有核和无核精子束的表面仍然光滑、致密，与野生型无明显差异。然而，对交配囊中解离的有核正常精子的SEM观察发现，相对于野生型雄虫直而光滑的鞭毛，突变体雄虫的有核正常精子鞭毛显示出不规则的局部肿胀。在此基础上，我们通过透射电镜进一步分析精子以表征鞭毛超微结构。在野生型有核正常精子中，鞭毛由典型的“9+9+2”轴丝和两个大小均匀的线粒体衍生物组成，每个MD被膜结构包裹并充满致密的拟结晶物质。在LTNAT突变体中，有核正常精子的“9+9+2”轴丝排列保持完整，但MDs的超微结构发生显著改变：拟结晶物质沉积减少、包裹MDs的膜结构被破坏、MDs严重肿胀。这些异常与SEM观察到的沿鞭毛的局灶性肿胀一致。对无核辅助精子的TEM分析显示，野生型和突变体雄虫的精子横截面同样呈椭圆形，包含单个“9+9+2”轴丝和两个相对较小的MDs，表明LTNAT突变不影响无核辅助精子的超微结构。
2.7 LTNAT敲除诱导线粒体功能障碍并抑制马达蛋白
为阐明LTNAT如何调节MDs形成和精子运动力，我们对1日龄野生型和突变体雄虫的睾丸进行了整合转录组和蛋白质组分析。转录组分析鉴定出556个差异表达基因。KEGG和GO富集分析显示，突变体中下调的基因主要与能量代谢、微管依赖过程和跨膜运输相关。值得注意的是，多个参与微管依赖性运动的轴丝动力蛋白重链基因被强烈下调。与受损的线粒体能量代谢一致，突变体精子中的ATP水平显著降低。在蛋白质组水平，我们量化了6521个蛋白质。亚细胞定位分析显示，突变体和野生型之间的差异表达蛋白主要位于线粒体，这与MDs中观察到的超微结构异常一致。整合的KEGG和GO分析表明，下调的蛋白质在与能量产生和膜生物合成密切相关的脂质代谢过程中显著富集。基因集富集分析进一步揭示了参与微管依赖性运动的蛋白质（主要是动力蛋白）显著下调。差异表达蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析确定了三个功能上一致的模块：解毒和脂质代谢、细胞稳态、以及纤毛/鞭毛组装。值得注意的是，鞭毛模块包含鞭毛内运输复合体亚基IFT74、IFT88和IFT172，这些对小鼠的轴丝组装和精子运动至关重要。相比之下，突变体中上调的基因和蛋白质在氧化还原过程、多种代谢途径和DNA整合中富集。结果表明，细胞在应对能量耗竭和膜脂损伤时经历了补偿性代谢重编程，以限制氧化损伤和基因毒性应激。
在整合的多组学分析中，我们鉴定了20个在转录和蛋白质水平上均差异表达的基因，其中16个显示出表达水平的一致变化。值得注意的是，Sxl在突变体雄虫中显著下调。家蚕的遗传研究表明，Sxl突变导致无核辅助精子发育异常和运动能力丧失。鉴于关键精子基因在小鼠和鳞翅目之间的功能保守性，我们假设LTNAT敲除可能通过下调DNAH和IFT基因的表达来降低无核辅助精子的运动能力。总体而言，我们的多组学数据支持一个模型：LTNAT突变破坏了线粒体能量代谢和膜脂稳态，可能导致渗透压失衡和MDs异常。同时，LTNAT敲除可能通过降低Sxl和DNAH/IFT家族基因的表达来损害无核辅助精子的运动能力。
2.8 过量释放LTNAT-/-雄虫抑制雌性生育力
最后，我们评估了在笼养条件下大量释放LTNAT突变体雄虫是否能抑制种群增长。适应性成本分析表明，LTNAT突变不影响雄虫寿命或交配竞争力。随后，我们将突变体雄虫和野生型雄虫以5:1的比例引入含有12只处女雌虫的饲养笼中。与仅包含野生型雄虫的对照组笼子相比，引入过量突变体雄虫的笼子产生的后代数量显著减少。这些发现表明，LTNAT是鳞翅目害虫遗传控制的一个有前景的分子靶点。
3 讨论
本研究鉴定并功能表征了草地贪夜蛾中一个鳞翅目保守的、睾丸特异性的芳烷基胺N-乙酰转移酶。LTNAT的缺失导致有核正常精子MDs的形态异常和无核辅助精子运动能力的下降。整合的多组学分析进一步表明，LTNAT是维持精子细胞能量产生、脂质代谢和跨膜运输稳态的关键因子。在表达调控层面，LTNAT突变可能通过下调Sxl和DNAH/IFT家族基因的表达来损害无核辅助精子运动力。这些发现共同确立了LTNAT作为蛾类雄性生育力的核心调控因子，并提示了控制二分法精子发生的潜在机制。
结合组学和基因编辑技术的快速发展，越来越多的生殖发育相关基因被鉴定。在这里，我们首先比较了1日龄雄成虫睾丸、附腺和躯干的转录组谱，以筛选睾丸特异性基因。结合CRISPR/Cas9介导的基因编辑，我们鉴定了一个先前未表征的雄性不育基因LTNAT。尽管昆虫aaNATs通常显示出较低的氨基酸序列一致性，但其三级结构在整个家族中是高度保守的。与此一致，LTNAT与果蝇的DmagmNAT序列一致性低，但具有高度相似的整体折叠和保守的基序组织。其中，基序A和基序B分别形成乙酰辅酶A和底物的结合位点，而基序C和基序D稳定整体蛋白质结构。此外，LTNAT拥有昆虫aaNATs的另一个典型特征：位于β3和β4之间的螺旋元件。昆虫拥有多个aaNATs来调节生物胺的代谢和脂肪酸酰胺的生物合成。使用DTNB比色法，我们进一步表明重组的LTNAT催化两类生物胺的N-乙酰化：多胺和芳香胺。与赤拟谷盗的TcaaNAT1类似，LTNAT表现出相对广泛的底物谱，表明其功能可能超越单一代谢途径。先前的研究表明，昆虫aaNATs在神经递质失活、色素沉积、角质层骨化和卵巢发育中发挥重要作用。相比之下，我们发现LTNAT特异地调控蛾类的雄性生育力，其缺失导致雄性完全不育，为昆虫aaNATs家族内的功能多样化提供了新的视角。
因为有核正常精子负责受精，其发育或转移的缺陷通常直接导致雄性不育。先前的研究已经鉴定出多个特异性控制有核正常精子中细胞核定位以及有核正常精子迁移到雌性生殖道的关键基因。与之相反，LTNAT突变既不改变有核正常精子中的细胞核定位，也不完全阻止其在交配期间向雌性的转移。相反，我们发现了一个先前未报道的表型：LTNAT缺失导致有核正常精子鞭毛沿程出现明显的点状肿胀。免疫细胞化学分析显示，LTNAT主要在有核正常精子中表达，在鞭毛区域信号最强。结合SEM和TEM分析揭示，在突变体有核正常精子中，拟结晶物质减少，包裹MDs的膜被破坏，MDs发生肿胀。线粒体是精子鞭毛的组成部分，在维持鞭毛结构完整性和为鞭毛摆动提供能量方面发挥核心作用。在多个物种中的研究表明，线粒体功能障碍常常导致雄性不育。因为有核正常精子无法主动迁移通过雌性生殖道，我们推测有核正常精子的MDs主要为卵子激活或早期胚胎发育提供能量储备和结构支持。进一步的富集分析显示，参与能量代谢、膜脂合成和跨膜运输的基因在突变体雄虫中显著下调。因此，我们推断LTNAT缺失损害了线粒体能量产生并破坏了膜脂完整性，共同增加了MDs内部的渗透压，导致水流入和肿胀。
运动的无核辅助精子协助有核正常精子从交配囊转移到受精囊。因此，无核辅助精子运动能力的损伤或丧失也会导致雄性不育。与先前的研究一致，我们发现敲除LTNAT显著降低了无核辅助精子的运动能力，并阻止了有核正常精子到达受精囊。免疫组化分析证实，LTNAT也在无核辅助精子中表达。然而，与在有核正常精子中观察到的超微结构缺陷不同，LTNAT的缺失并未改变无核辅助精子的外部形态或内部的轴丝和MDs结构。多组学数据进一步显示，DNAH和IFT蛋白家族的多个成员在突变体睾丸中下调。DNAH和IFT蛋白对于维持哺乳动物鞭毛结构完整性和有效的精子运动力至关重要。尽管昆虫和哺乳动物的生殖系统在解剖学上不同，但精子发生的遗传基础部分是保守的。此外，精子和纤毛的核心结构和驱动机制在动物界是高度保守的。因此，从机制角度来看，我们假设LTNAT敲除通过降低DNAH/IFT家族基因的表达水平间接损害了无核辅助精子的运动能力。我们还观察到Sxl表达在突变体中显著下调。先前的研究表明，Sxl突变导致无核辅助精子MDs缺陷和运动能力完全丧失。但我们认为，Sxl下调水平在这些不同遗传背景下的后果有所不同。
精液蛋白在交配过程中被转移到雌性生殖道，并引发一系列生理和行为反应。多项研究表明，精液蛋白对无核辅助精子的激活至关重要。因此，我们考虑了LTNAT是否在精荚内作为精液蛋白发挥作用。精液蛋白主要在雄性附腺中合成，并在复射精管中与精子混合。我们的数据显示，LTNAT不在雄性附腺中表达，也不被转移到精荚中。此外，LTNAT突变直接引起有核正常精子显著的形态变化。这些观察表明，LTNAT更可能作为一种内在的精子蛋白，参与双型精子的发育和功能调节。
LTNAT调节精子发生的精确分子机制仍不清楚，这很大程度上是由于精子细胞中多胺代谢稳态的失衡。多胺在睾丸和精子中含量丰富，它们与核酸和带负电荷的膜脂强烈结合。多胺丰度的失调会破坏正常的精子发生和精子运动力。基于我们的多组学数据和现有文献，我们为LTNAT在二分法精子发生中的调控机制提出了以下工作假设：1）在有核正常精子中：LTNAT功能丧失可能导致带正电荷的多胺在线粒体衍生物内过度积累。这种积累可能破坏膜曲率，损害线粒体嵴的有序排列，并干扰拟结晶物质的沉积，最终导致线粒体衍生物肿胀和拟结晶物质减少。2）在无核辅助精子中：LTNAT可能调节多胺信号通路，以调节多种运动相关因子（包括Sxl和纤毛/鞭毛组装蛋白）的转录或稳定性。这些因子的联合减少可能共同削弱无核辅助精子的运动能力。未来整合代谢组学和转录组学的研究对于鉴定LTNAT的内源性底物以及确定此类代谢扰动如何最终影响运动基因的表达和无核辅助精子功能至关重要。
基于CRISPR/Cas9的精准引导不育昆虫技术在害虫管理中前景广阔。鉴定鳞翅目害虫中靶向精子蛋白的雄性不育基因将为该技术或其他基于不育雄虫的技术提供分子靶点。多项笼养实验表明，释放过量的不育雄虫可以显著减少野生型雌虫的后代产生。我们首先评估了LTNAT突变对雄虫生存和交配竞争力的影响，这是建立该技术系统的两个关键性状。我们的结果表明，LTNAT突变不损害雄虫的生存能力或交配能力，并且在竞争性交配条件下大量释放突变体雄虫显著减少了后代数量。这些发现表明，LTNAT是害虫控制的一个有前景的分子靶点。由于LTNAT在鳞翅目昆虫中高度保守，但与其他昆虫目的序列一致性低，它也具有作为高特异性杀虫剂
