《Advanced Science》：A Soft Matrix Microenvironment Promotes Laterally Spreading Tumors via Oxidative Phosphorylation-Dependent Cell Adhesion
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本文通过整合单细胞与空间转录组、临床样本及类器官模型，系统揭示了早期大肠侧向发育型肿瘤（LST）独特的“横向扩散”生长模式背后的分子与微环境机制。研究发现，相较于传统的隆起型腺瘤（PA），LST定位于更柔软的细胞外基质（ECM）中，其上皮细胞表现出更高的拷贝数变异（CNV）和恶变风险，并伴随着氧化磷酸化（OXPHOS）的显著增强。这种代谢重编程与细胞粘附分子的下调、细胞骨架去聚合紧密偶联，共同构成了促进肿瘤侧向扩散的“力学-化学”轴。进一步研究揭示了基质硬度通过ENTPD1-ADORA2B信号轴调控这一过程。该研究不仅为LST的早期诊断和干预提供了新见解，也提示靶向基质力学或代谢轴是潜在的治疗策略。
引言：临床挑战与科学问题
侧向发育型肿瘤（Laterally spreading tumors, LSTs）是大肠中一种特殊的早期癌前病变，其特点是沿粘膜表面或肠壁周向横向扩展超过10毫米。与传统的隆起型腺瘤（protruding adenomas, PAs）相比，LSTs因其平坦的形态和细微的粘膜特征，在内镜检查中更容易被漏诊。更重要的是，LSTs表现出更高的恶性潜能，包括更高的粘膜下浸润风险和内镜切除后局部复发率。尽管组织学上可能相似，但LSTs独特的横向生长模式暗示了其背后存在未被充分理解的分子差异。特别是，LSTs内部的非颗粒型（LST-NG）亚型比颗粒型（LST-G）具有更高的恶变风险。尽管其临床意义重大，但驱动LSTs特征性侧向扩展的分子和微环境机制在很大程度上仍是未知的。肿瘤的扩张与细胞变形能力紧密联系着癌细胞和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的生物物理特性。在许多实体瘤中，ECM硬化是进展的常见特征。然而，高度转移性的肿瘤细胞通常比良性细胞更“柔软”，且动态的刚性变化可以促进细胞在柔软基底上的快速迁移。细胞粘附的重组在调节细胞-基质相互作用中起着关键作用。本研究旨在通过整合单细胞转录组学、空间转录组学和患者来源类器官模型，探索LST进展的细胞和分子基础，特别关注基质微环境的作用。
结果1：多维分析揭示LSTs更高的恶性潜能特征
对来自四个医疗中心的4488例病例的临床和组织病理学数据分析显示，LSTs的平均面积大约是PAs的十倍，并且更频繁地被归类为高风险内镜亚型。组织学评估进一步证实，LSTs中高度不典型增生、癌成分和粘膜下浸润的发生率显著高于PAs。对公共批量转录组数据集的分析发现，与LST相关的基因模块富集了与多种恶性肿瘤相关的转录程序。通过对21个样本（7个正常组织NT， 7个PA， 7个LST）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行整合分析，获得了90,134个高质量转录组，并注释了九种主要细胞类型。值得注意的是，LST样本中富含具有中等和高拷贝数变异（copy number variation, CNV）水平的上述细胞群体，其中超过一半来自LSTs。使用PROGENy进行的肿瘤相关通路评分显示，LST上皮细胞中多种致癌信号通路（如PI3K, EGFR, 缺氧, MAPK）被显著激活。为了在体外重现LSTs的生长行为，研究建立了来自LST和PA病变的患者来源类器官。与PA来源的类器官相比，LST来源的类器官表现出显著升高的Ki-67表达、更大的横向面积扩展和更高的出芽率。这些发现突出了LSTs更高的恶性潜能。
结果2：解析上皮细胞的转录组特征与进化轨迹
对上皮细胞进行深入分析，确定了17种不同的上皮亚型。差异丰度分析揭示了组织特异性偏好：ASC1和ASC2在所有三组中均存在，但在LSTs中占主导，而ASC3主要在PAs中检测到。聚类EPI1, EPI2, EPI3和EPI5在LSTs中显著富集，并且与通过scPagwas计算得出的更高结直肠癌（colorectal cancer, CRC）风险评分相关。比例分析进一步显示，CRC风险相关的阳性细胞优先富集在具有较高推断CNV评分的群体中。此外，LST上皮细胞的特征是聚糖降解和包括OXPHOS在内的代谢过程。对按推断CNV水平分层的细胞进行功能分析发现，具有中、高CNV评分的LST细胞与OXPHOS、多种线粒体过程以及CDH1（E-cadherin）表达和功能的调节相关。相比之下，细胞骨架组织相关过程在具有相当高CNV评分的PA细胞中更频繁富集。为了追踪LST进展过程中具有不同推断CNV特征的细胞的发育作用，进行的拟时序分析揭示了一条独特的分化轨迹：低推断CNV细胞主要占据早期状态，而中、高推断CNV细胞在终末状态富集。基因表达动态显示，CRC风险基因呈现“低-高-低”模式，在中间过渡态达到峰值；而OXPHOS基因则呈现“高-低-高”趋势，在中间阶段下降，随后在终末LST状态反弹。
结果3：氧化磷酸化的增强是LST发展的关键事件
通路富集和hdWGCNA分析均显示，OXPHOS在LSTs中上调。表征OXPHOS和线粒体能量产生的模块EPI-M4在LSTs中高表达。对PA富集的上皮簇EPI-M1和EPI-M3的分析则呈现了对比鲜明的特征：EPI-M1与结构刚性和极性维持相关，而EPI-M3显示出压力反应特征。临床组织样本和体外类器官实验证实了这些转录组发现，显示LSTs中关键OXPHOS组件（NDUFB8, SDHA, UQCRFS1, MTCO1）的表达上调。在LST来源的类器官中，OXPHOS抑制剂Gboxin处理显著降低了类器官的生长面积，而在PA来源的类器官中则没有显著变化，表明LST来源的类器官对OXPHOS抑制具有更高的特异性敏感性。
结果4：增强的氧化磷酸化特征与LSTs中粘附分子下调相偶联
根据中位OXPHOS特征评分将上皮细胞分为OXPHOShigh和OXPHOSlow亚群。差异表达分析显示，在LST的OXPHOShigh细胞中，细胞连接通路（包括粘着斑、紧密连接、粘附连接、细胞-基底连接）相对于OXPHOSlow细胞下调。细胞连接蛋白、钙粘蛋白、桥粒蛋白和紧密连接调节基因在OXPHOShigh上皮细胞中显著下调。与紧密连接组装、细胞-细胞连接组织和细胞极性维持相关的特征在LSTs中 consistently 得分最低。空间转录组学分析显示，与PA相比，LST样本中粘附相关基因（如CDH17, DSC2）在上皮各层中显著下调。免疫组织化学和免疫荧光分析在临床组织和类器官中验证了粘附分子的差异表达。透射电镜超微结构分析显示，LST来源类器官中紧密连接和桥粒的电子致密结构长度和宽度显著缩短变窄。用OXPHOS抑制剂Gboxin处理可显著恢复LST来源类器官中粘附相关分子的表达。细胞骨架动力学研究显示，下调基因富集于肌动蛋白丝组织通路，LST来源类器官中观察到显著的肌动蛋白纤维解聚，而Gboxin处理诱导了细胞骨架聚集。相反，细胞骨架解聚剂细胞松弛素D（Cytochalasin D, CytoD）进一步抑制了LST类器官中粘附分子的表达。
结果5：LST上皮细胞与基质细胞在基质微环境中的分子相互作用
非负矩阵分解（non-negative matrix factorization, NMF）分析在LST上皮细胞中识别出与ECM相关的基因程序。细胞相互作用分析显示，基质细胞是与上皮细胞相互作用数量和强度最高的信号来源。通路富集分析表明，LST基质细胞中粘着斑、紧密连接和肌动蛋白细胞骨架或丝调节通路下调。对差异表达基因的进一步检查发现，胶原蛋白表达在LST基质细胞及其空间景观中普遍较低。单细胞和空间通讯分析均显示，PAs中胶原蛋白相关的配体-受体相互作用比LSTs更强。尽管具有侵袭性扩散，LST上皮细胞却表现出经典的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）程序静息。转录组数据显示，阿米巴样、肌动球蛋白和蛋白酶非依赖性基因程序同时富集，指向一种潜在的混合迁移模式。
结果6：早期肠道肿瘤的横向生长与更柔软的基质微环境相关
使用内镜超声弹性成像评估病变与相邻正常组织的应变比（strain ratio, SR），LST病变表现出显著更低的SR值，表明基质微环境更软。原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）对临床样本的直接测量显示，LST组织的杨氏模量值显著低于PA组织。免疫组化分析进一步显示，与PAs相比，LSTs的粘膜和粘膜下层中I型胶原（COLLAGEN I）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）的表达减少。为了在功能上探索更软基质环境与LST发展的关联，将患者来源类器官培养在不同硬度的二维基质上。LST来源的类器官在柔软基质上表现出显著增强的横向扩张，而PA来源的类器官则没有显示出显著的硬度响应性生长差异。细胞浓度定量评估显示，软硬基质条件之间没有显著差异，表明观察到的面积增加主要反映了形态扩展和细胞重排，而非细胞增殖。
结果7：ENTPD1–ADORA2B信号响应基质硬度调控LST进展
为了探索软基质微环境如何与LST进展中的关键通路相互作用，将LST来源类器官培养在不同硬度的基质上。在柔软基质上生长的类器官表现出细胞连接和细胞骨架蛋白的显著下调，同时伴有OXPHOS组分的上调。为了识别与这些变化相关的潜在机械敏感表面受体，使用MultiNicheNet进行了细胞-细胞通讯分析。在LSTs中，基质细胞主要通过ENTPD1-ADORA2B轴与OXPHOShigh细胞相互作用，显示出最高的配体和受体活性及组织特异性。下游通路分析显示，cAMP信号和腺苷代谢在LSTs中活性最高。对LST上皮细胞进行ADORA2B的计算机敲除模拟，扰动基因富集于细胞-细胞连接、肌动蛋白细胞骨架、细胞形态和代谢调节相关通路。将LST上皮细胞分为ADORA2B+和ADORA2B-亚群，KEGG富集分析显示ADORA2B+亚群OXPHOS上调最显著，而经典粘附连接通路显著下调。用选择性ADORA2B拮抗剂ZM241385处理LST来源类器官，在软基质条件下，ADORA2B抑制显著降低了类器官的横向扩张，并减弱了硬度响应性的生长优势。免疫荧光分析显示，ADORA2B抑制导致连接蛋白和细胞骨架组分表达显著上调。
讨论
本研究通过整合多组学技术和类器官模型，首次提供了LST的多维细胞和分子图谱。研究发现LSTs获得更具恶性的分子表型，并具有更强的CRC遗传风险富集。功能实验证明，OXPHOS升高与上皮粘附分子下调紧密相连，从而促进LST进展。细胞间相互作用分析和类器官实验支持一个模型，即软化的ECM微环境是适应LSTs特征性侧向扩展和恶性演变的关键生态位。虽然LST上皮细胞的内在特性是其基础，但独特的横向扩散行为不能完全由内在特性解释。研究表明，LSTs中OXPHOS的显著增加与紧密连接蛋白、E-钙粘蛋白和桥粒成分的大量抑制同时发生。轨迹分析进一步揭示了这种代谢可塑性，观察到的“高-低-高”OXPHOS模式暗示了阶段特异性代谢转换。研究还表征了PA富集的上皮细胞群，它们展现出“生长约束”和“稳态”的分子特征。从生物物理角度看，除了细胞内在改变，支持肿瘤的微环境似乎对适应侧向扩展至关重要。集成临床超声弹性成像、单细胞转录组学和类器官微环境建模，研究证明LST病变拥有明显更软的ECM和相对于PAs及NTs减少的基质沉积。LSTs的“柔软”特性是通过“硬化受损、主动软化和过度蛋白水解”的三方机制协同维持的。转录组分析支持一种“双重可塑性”模型，即LSTs独特地共同利用蛋白水解和收缩机制在其微环境中迁移。总的来说，研究结果支持一种肿瘤细胞内在程序与机械微环境协同进化的模型。内在改变是肿瘤转化和增殖的基本组成部分，但单独的它们无法解释宏观形态。相反，机械上“柔软”的ECM作为一个关键物理调节器和允许的生态位，通过时空激活机械敏感的ENTPD1-ADORA2B轴，有效引导内在恶性细胞走向侧向扩散轨迹。
材料与方法
临床数据收集自四个中心的3000例PA患者和1488例LST患者。通过内镜粘膜切除术（endoscopic mucosal resection, EMR）或内镜粘膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection, ESD）获取样本进行单细胞和空间转录组测序。患者来源类器官通过组织消化、Matrigel包埋并在结肠癌类器官培养基中培养获得。通过内镜超声弹性成像测量病变的弹性应变比。使用10x Genomics平台进行单细胞RNA-seq文库制备。数据预处理使用Cell Ranger和Seurat包。采用Harmony算法进行批次校正和整合。使用多种工具进行差异表达基因、通路富集、基因集富集、加权基因共相关网络、细胞轨迹推断、细胞间通讯等分析。通过InferCNV评估单细胞拷贝数变异。使用PROGENy评估肿瘤相关信号通路活性。应用非负矩阵分解识别基因程序。通过scPagwas整合单细胞转录组与GWAS数据评估遗传风险。进行了广泛的敏感性分析（包括留一供者分析）以确保研究结果的稳健性。
