《Advanced Science》：Enzyme-Activated MRI for In Vivo Glucose Imaging via a Biodegradable Chromium Nanoprobe
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本文介绍了一项具有突破性的“酶激活磁共振成像(Enzyme-activated MRI, eaMRI)”策略。研究人员设计了一种可生物降解的纳米探针CrGOx@Lip，其核心是将内源性铬离子(Cr3+)与葡萄糖氧化酶(GOx)集成，从而将酶催化的葡萄糖特异性氧化事件转化为可检测的MRI T1加权信号。该策略成功实现了对活体内葡萄糖代谢的无创、高特异性可视化，在肿瘤（瓦博格效应）和代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)模型中均得到验证，为精准医学代谢诊断提供了新工具。
1 引言
葡萄糖是贯穿癌症、代谢紊乱和肝脏疾病的关键生物标志物，然而活体内葡萄糖的非侵入性成像仍面临重大挑战。现有技术难以在具备深层组织穿透力且无电离辐射的前提下特异性检测葡萄糖分子。虽然18F-FDG PET是葡萄糖代谢成像的临床金标准，但它涉及电离辐射暴露，且作为葡萄糖类似物无法直接区分葡萄糖与其结构类似物，在炎症条件下可能导致假阳性。因此，迫切需要一种葡萄糖特异性、高穿透力、无放射性的成像策略来评估复杂生物环境中的葡萄糖代谢。
磁共振成像(MRI)因其卓越的空间分辨率、非侵入性能力和有效的组织穿透力，是代谢成像中极具前景的方法。然而，常规结构MRI无法直接特异性检测葡萄糖。化学交换饱和转移(CEST)方法如gluco CEST通过利用糖的可交换质子开创了葡萄糖衍生对比，但其在临床3 T以下场强下固有灵敏度低、采集时间长且易受内源性代谢物干扰。这些局限性凸显了对兼具高灵敏度和高特异性的葡萄糖分子MRI探针的迫切需求。
基于此，本研究开发了酶激活磁共振成像(eaMRI)策略。该策略利用酶-底物相互作用的特异性和催化能力，克服传统成像的关键限制。为实现eaMRI，核心挑战在于将酶催化事件转化为可检测的MRI信号。本研究独特地将葡萄糖氧化酶(GOx)催化与纳米材料信号放大相结合。我们设计的GOx工程化铬纳米探针(CrGOx)利用GOx的双重作用：既作为生物模板，也作为酶激活剂。在葡萄糖暴露时，GOx催化氧化过程中释放的氢离子(H+)溶解生物矿化的Cr(OH)3，原位形成顺磁性的铬葡萄糖酸盐。这是一种膳食补充剂螯合物，保留了高弛豫率的同时消除了游离离子毒性风险，能以高特异性将T1对比放大超过8倍。脂质体封装(CrGOx@Lip)可防止探针过早激活，同时能实时绘制肿瘤葡萄糖摄取图、量化MAFLD中的病理性肝葡萄糖积累，并评估代谢干预的治疗效果。
1增强机制(q：水合数)。(b)活体实体瘤实时葡萄糖成像和MAFLD中肝葡萄糖积累。">
2 结果与讨论
2.1 酶激活MRI(eaMRI)：策略与CrGOx探针的制备
为实现eaMRI，我们设计并制备了能够将目标区域内酶促反应能量转化为可量化MRI读数的响应性探针。具体而言，我们利用GOx催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸盐并释放H+。该反应策略性地与酸敏感的Cr(OH)3基质耦合，后者在局部酸性条件下溶解，原位形成顺磁性铬葡萄糖酸盐，从而产生强MRI T1信号。
基于此机制，我们通过GOx模板化生物矿化构建了一种混合探针CrGOx，用于灵敏且特异的葡萄糖成像。选择Cr3+作为MRI对比元素，因为它是能够加速纵向质子弛豫的顺磁性离子。Cr3+的弛豫率与其配位环境高度相关，特别是内层水分子的数量和水交换动力学。此外，它是人体必需的微量元素，在葡萄糖和脂质代谢调节中起重要作用。GOx既作为生物模板也作为螯合支架，使来自Cr(NO3)3的Cr3+配位形成均匀的纳米颗粒。
表征显示，Cr3+在添加GOx后紫外-可见(UV-vis)吸收峰从410 nm移至418 nm，表明Cr3+离子与GOx相互作用。CrGOx在403和576 nm处出现特征吸收峰，证实了Cr3+被纳入CrGOx结构。透射电子显微镜(TEM)结果显示CrGOx呈矩形结构，平均直径约26 nm。动态光散射(DLS)测量显示流体动力学直径约44 nm，比TEM测得尺寸略大，这可归因于GOx富集的外层在水溶液中贡献了流体动力学尺寸。元素映射结果显示铬和氧在CrGOx纳米颗粒内均匀分布。X射线吸收精细结构(XAFS)分析表明，CrGOx中铬的氧化态介于+3和+4之间。扩展X射线吸收精细结构(EXAFS)分析表明，Cr中心平均Cr-O配位数为5.2 ± 0.2，键长为1.98 ?。X射线光电子能谱(XPS)分析显示结合能峰在577.0 eV (2p3/2)和586.8 eV (2p1/2)，这是Cr(OH)3中Cr3+的特征。这些结果共同表明CrGOx中铬的主要形式是Cr(OH)3。圆二色(CD)光谱显示GOx在纳米复合材料中的二级结构发生改变，其特征负峰从222 nm红移至234 nm，峰强度降低59.9%。关键的酶活性测定表明，相对于未修饰的GOx，CrGOx保留了其39.2%的天然催化能力，证实了尽管结构重组但仍保持功能完整性。
3)3的Cr3+离子、GOx与Cr3+的物理混合物(GOx+ Cr3+)以及合成的CrGOx的紫外-可见吸收光谱。(b)CrGOx的TEM图像。(c)GOx和CrGOx的动态光散射(DLS)分析。(d)CrGOx的元素分布图。(e)CrGOx的EDS能谱。(f)Cr K边XANES光谱。(g)FT-EXAFS光谱。(h)Cr箔、CrGOx、Cr(OH)3和CrO2的Cr K边信号的WT图。(i)Cr在R空间的EXAFS光谱拟合曲线。(j)CrGOx的XPS能谱(Cr 2p)。(k)游离GOx和CrGOx的圆二色谱。">
2.2 CrGOx的葡萄糖响应弛豫特性
CrGOx表现出显著的葡萄糖依赖性弛豫率调节，验证了其作为酶激活MRI探针的设计。CrGOx的初始纵向弛豫率(r1)低至0.18 mM-1·s-1，但在10 mM葡萄糖时增加了8.28倍，达到1.67 mM-1·s-1，表现出葡萄糖浓度依赖性放大。相应地，CrGOx的T1加权MRI信号强度在0-10 mM葡萄糖范围内显示出葡萄糖依赖性增强，定量分析显示在10 mM葡萄糖时(2 mM CrGOx)信号强度相比无葡萄糖组增加了3.28倍。横向弛豫率(r2)仅轻微扰动，在10 mM葡萄糖时从0.70略微增加至2.12 mM-1·s-1，产生了最佳的r2/r1比值1.27，有利于T1加权成像。
动力学研究揭示了CrGOx对葡萄糖的快速激活。在10 mM葡萄糖下，CrGOx的T1弛豫时间在60分钟内急剧下降，而在无葡萄糖暴露时保持稳定。特异性筛选进一步证实了对葡萄糖的排他性响应。在干扰物(果糖、乳糖、半乳糖、谷氨酰胺、谷氨酸、H2O2、血红蛋白、人血清白蛋白、pH 6.5缓冲液)中，只有葡萄糖能显著诱导1/T1增加。这种选择性响应模式通过T1加权成像和定量信号强度分析得到验证。为验证GOx在CrGOx中的催化功能，我们使用牛血清白蛋白(BSA)作为模板合成了不含GOx的探针CrBSA。对照实验显示CrBSA对葡萄糖无响应，明确将CrGOx的激活归因于GOx介导的酶识别。
1加权MRI，以及(c)不同葡萄糖浓度下CrGOx的信号强度。(d)不同葡萄糖浓度下CrGOx的T1弛豫时间随时间变化。(e)T1弛豫时间，(f)体外T1加权MRI，以及(g)CrGOx在10 mM浓度的葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、谷氨酰胺、谷氨酸、血红蛋白、人血清白蛋白(HSA)和pH 6.5缓冲液中的信号强度。(h)不同葡萄糖浓度下CrBSA的T1弛豫时间和(i)T1加权MRI。">
2.3 葡萄糖响应弛豫率机制
结构分析确定Cr(OH)3是CrGOx中铬的主要物种。鉴于其两性性质，我们假设局部pH的降低——来自GOx催化氧化过程中释放的H+——介导了Cr(OH)3核心的酸溶解，形成顺磁性螯合物。为验证此机制，我们解耦了催化产物。H2O2暴露(0-5 mM)在180分钟内对CrGOx诱导的T1弛豫时间变化可忽略不计，而葡萄糖酸(5 mM)在30分钟内触发T1从154 ms快速降至124 ms。体外MRI分析显示，CrGOx和无GOx的CrBSA均表现出酸依赖性信号放大。为阐明信号放大是由局部pH降低还是由葡萄糖酸盐驱动，我们进行了补充实验。当CrGOx与葡萄糖酸钠(pH 7.4)孵育时，与单独的CrGOx相比未观察到T1加权MRI信号的显著变化。相反，与盐酸(HCl)孵育导致T1信号显著增加。对照纳米颗粒CrBSA观察到相同模式，证实响应主要由酸性条件而非葡萄糖酸盐驱动。
葡萄糖作用后的结构表征显示CrGOx纳米颗粒部分降解。上清液组分的紫外-可见吸收光谱在432和550 nm处显示出特征性Cr3+吸收峰，相应的T1加权MRI信号比沉淀物高2.97倍。葡萄糖浓度依赖性信号增强(0-20 mM)仅见于上清液。EDTA螯合测定定量了逐渐增加的Cr3+释放，从1 mM葡萄糖时的16.3%增加至20 mM葡萄糖时的68.4%。这些结果表明，CrGOx中铬的配位形式在葡萄糖响应后发生变化。我们进一步研究了催化后铬的最终形式。结果表明，游离Cr3+离子显示出比葡萄糖暴露后的CrGOx显著更高的r1弛豫率，表明溶解的CrGOx并未以游离Cr3+离子形式存在。经紫外-可见光谱与标准品比对(λmax= 432/548 nm)以及质谱检测到m/z 442 ([Cr(C6H11O7)2]-)和m/z 638 ([Cr(C6H11O7)3-H]-)分子离子，确定催化后铬的最终形式为铬葡萄糖酸盐。值得注意的是，铬葡萄糖酸盐是一种生物相容性膳食补充剂。
Solomon-Bloembergen-Morgan理论呼应了以下机制：虽然CrGOx的稳定Cr-O配位(5.2 ± 0.2)限制了水配位(q ≈ 0)，但催化后形成的铬葡萄糖酸盐([Cr(C6H11O7)2 或 3]-)增加了内层水配位位点(q ≥ 1)，这解释了8.28倍的r1增强，即在10 mM葡萄糖时从0.18增加至1.67。这一系列事件——酶促葡萄糖氧化、局部H+和葡萄糖酸盐释放、Cr(OH)3溶解以及顺磁性铬葡萄糖酸盐形成——实现了葡萄糖特异性MRI对比放大。
2O2和(b)葡萄糖酸浓度下的T1弛豫时间。(c)不同葡萄糖酸浓度下CrGOx和CrBSA的体外T1MRI。(d)与葡萄糖反应后CrGOx的TEM图像(箭头指向CrGOx的未反应部分)。(e)Cr3+、GOx、CrGOx、CrGOx+Glu混合物、上清液和沉淀物的紫外-可见吸收光谱。(f)体外T1MRI，和(g)CrGOx、CrGOx+Glu混合物、上清液和沉淀物的信号强度。(h)不同葡萄糖浓度下上清液和沉淀物的体外T1MRI。(i)通过EDTA螯合方法测定的上清液中Cr3+含量及相应的数字图片。(j)CrGOx葡萄糖响应T1信号增强的拟议机制示意图。">
2.4 肿瘤葡萄糖成像
利用瓦博格效应——即肿瘤优先摄取葡萄糖——我们评估了CrGOx用于肿瘤葡萄糖摄取成像的潜力。在通过尾静脉静脉给药之前，我们通过瘤内给药测试了CrGOx的MRI性能。携带CT26肿瘤的小鼠瘤内注射CrGOx产生了逐渐增加的信号，在40分钟时达到峰值。相比之下，对照CrBSA（含有与GOx相同的酸响应性Cr(OH)3核心但缺乏该酶）未引发可检测的响应。与放置在小鼠旁边的离体CrBSA样本的比较证实，瘤内CrBSA产生的信号变化可忽略不计，表明激活依赖于葡萄糖衍生的酸(pH < 3)，而非轻度酸性的肿瘤微环境(pH ～6.5)。此外，在酶-纳米颗粒界面产生的局部酸性条件创造了一个局部的、高浓度的酸性微区，直接溶解氢氧化铬并促进铬葡萄糖酸盐的形成。
为实现全身递送，我们将CrGOx封装在脂质体(CrGOx@Lip; 流体动力学直径173 nm)内。脂质体封装抑制了过早激活，这通过CrGOx@Lip组在210分钟内T1从1566 ms逐渐降至768 ms得到证明，而未封装的CrGOx在60分钟内从1539 ms急剧降至441 ms，表明在循环过程中酶催化被显著抑制。为评估我们成像探针的机制特异性，我们使用BAY-876（一种高亲和力GLUT1抑制剂）选择性阻断肿瘤细胞中的葡萄糖摄取。然后在未经处理和经BAY-876预处理的CT26荷瘤小鼠之间比较成像效果。结果显示，未经处理的小鼠在尾静脉注射CrGOx@Lip后表现出显著的ΔSNR%增强(60分钟时为13.47 ± 2.74%)；而经BAY-876预处理(抑制GLUT1)的小鼠显示出可忽略的信号变化(ΔSNR% = -0.59 ± 1.19%)。值得注意的是，在探针注射后120分钟进行腹腔葡萄糖注射，仅在CrGOx@Lip处理的小鼠中触发了240分钟时肿瘤信号强度的二次增加(ΔSNR% = 24.33 ± 3.98%)。这种增强反映了残留瘤内探针被外源性葡萄糖进一步激活，展示了良好的葡萄糖摄取监测能力。免疫荧光证实BAY-876组中GLUT1受到抑制，与成像特异性相关。总之，CrGOx@Lip实现了肿瘤选择性的葡萄糖成像，且能抵抗全身性干扰。
1弛豫时间。(e)研究CrGOx@Lip用于肿瘤葡萄糖摄取MRI的动物实验示意图。BAY-876(GLUT1抑制剂)处理或未处理的小鼠静脉注射CrBSA@Lip或CrGOx@Lip，并在120分钟后腹腔注射葡萄糖。(f)MR图像和(g)未处理小鼠静脉注射CrBSA@Lip和CrGOx@Lip，以及经BAY876预处理小鼠静脉注射CrGOx@Lip的定量肿瘤信号强度分析。">
2.5 代谢性肝病中的肝葡萄糖成像
代谢功能障碍相关脂肪性肝病(MAFLD)的特征是由胰岛素抵抗和葡萄糖生成失调驱动的病理性肝葡萄糖积累。我们进一步使用CrGOx@Lip无创监测这种代谢紊乱。在MAFLD小鼠中，静脉注射CrGOx@Lip后显示出进行性肝信号增强(240分钟时ΔSNR% = 18.51 ± 3.72%)，而健康对照组在静脉注射CrGOx@Lip后显示出可忽略的变化(ΔSNR% = 1.14 ± 1.39%)。这种成像对比与升高的肝内葡萄糖水平相关，并通过生化方法得到证实，且脂肪变性通过H&E染色验证，确立了CrGOx@Lip作为MAFLD相关代谢功能障碍的特异性成像工具。
我们进一步在奥贝胆酸(OCA)处理的MAFLD小鼠上展示了CrGOx@Lip的治疗监测能力。接受次治疗剂量OCA(1次和3次)的MAFLD小鼠表现出持续的CrGOx@Lip激活(ΔSNR%分别为20.74% ± 2.72%和17.66% ± 1.90%)，而完全治疗(9次)的小鼠显示出显著的代谢减少，其特征是T1信号增强被消除(ΔSNR% = 1.41% ± 1.53%)，肝葡萄糖水平正常化(5.01 ± 0.33 mM vs. 高血糖对照组)，以及脂滴的组织学清除。总之，这些结果表明，我们的eaMRI策略有效捕获了MAFLD中的病理性肝葡萄糖积累——这是一种由胰岛素抵抗介导的葡萄糖处置率降低(例如eGDR)所支撑的病症，在患病小鼠中表现为进行性信号增强，同时还能实现治疗反应的无创可视化，这在OCA处理模型中得到证明。
CrGOx@Lip的生物安全性得到了初步评估。CrGOx和CrGOx@Lip对L929细胞的细胞毒性测定显示，在Cr浓度高达10 mM时无显著生长抑制。Calcein-AM/PI染色进一步证实共孵育后L929细胞凋亡可忽略。CrGOx@Lip的血浆半衰期(t1/2)为0.56小时。生物分布分析显示，静脉注射后，探针主要富集在肝脏和脾脏，同时在肾脏中也检测到铬的存在，表明探针和形成的铬复合物逐渐通过肝胆和肾脏途径排泄。对尾静脉注射CrGOx@Lip的小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的组织学切片进行了检查。H&E染色显示在注射后1天和7天，这些器官均无组织学改变或细胞坏死的证据。
3 结论
本研究的动机是迫切需要一种非侵入性、特异性和灵敏的活体葡萄糖代谢成像方法，以增进对癌症和代谢紊乱的理解和管理。为应对这一挑战，我们开发了一种酶激活MRI(eaMRI)策略及相应的探针CrGOx，该探针通过酶触发原位形成顺磁性铬葡萄糖酸盐，实现了高灵敏度和葡萄糖浓度依赖性的对比增强。
该探针通过级联激活机制运行。具体而言，GOx催化的葡萄糖氧化产生葡萄糖酸盐并释放H+，后者溶解Cr(OH)3形成铬葡萄糖酸盐，增加了铬(III)的水配位数(q)，导致显著的T1对比增强，r1弛豫率增加了8.28倍。为确保转化应用，我们实施了脂质体封装(CrGOx@Lip)，平衡了系统稳定性与病灶特异性激活。该设计使得在两种不同的病理生理环境中可靠地成像葡萄糖通量成为可能，包括糖酵解肿瘤和MAFLD。在肿瘤模型中，CrGOx@Lip可视化瓦博格效应并对GLUT1抑制做出响应，突出了其在癌症诊断和治疗监测中的效用。在MAFLD中，它无创地量化了肝葡萄糖积累，并在奥贝胆酸治疗后追踪代谢改善，为侵入性活检提供了一种有前景的替代方案。
虽然18F-FDG PET仍是葡萄糖代谢成像的临床金标准，但我们的eaMRI策略提供了两个互补优势：无辐射操作以实现安全的纵向监测，以及通过酶特异性直接分子识别葡萄糖本身。传统的结构和功能MRI技术对成像小代谢分子提供的分子特异性有限。虽然磁共振波谱通过不同的光谱峰检测代谢特征，但由于其在临床场强下的可重复性问题，其临床使用仍然具有挑战性。基于gluco CEST MRI在葡萄糖依赖性对比方面的开创性工作，我们的方法通过最小化内源性代谢物的干扰，提供增强的特异性，实现葡萄糖选择性信号放大。
在我们的设计中，GOx在纳米颗粒表面创建了一个紧密的酶-基质界面，将H+的产生定位在纳米颗粒表面，从而实现高效的Cr(OH)3溶解和原位铬葡萄糖酸盐形成。这种限制最小化了扩散损失，并增强了MRI信号放大的催化转换。GOx固有的底物特异性确保了葡萄糖排他性激活，直接转化为成像特异性，这通过对干扰物的可忽略响应以及在糖酵解肿瘤和代谢性肝病模型中的清晰区分得到证实。通过将酶识别与纳米材料赋能放大相结合，我们的平台实现了分子成像所需的特异性和灵敏度。
CrGOx@Lip的一些局限性需要注意。其流体动力学尺寸(～173 nm)虽然有助于循环，但可能限制对纤维化或灌注不良组织的渗透。此外，该探针无法解析异质环境中细胞类型特异性的葡萄糖摄取。未来的设计可以采用更小的、可激活的探针或组织穿透肽来增强扩散。结合细胞特异性靶向基序或多重成像可能有助于区分不同细胞群的葡萄糖摄取。该探针的激活动力学目前受限于部分GOx失活和信号转导。正在进行的工作旨在优化生物矿化条件，以更好地保存酶活性并实现更快的葡萄糖响应。
通过eaMRI实现的显著葡萄糖依赖性T1信号放大，证明了其作为一种分子成像策略的前景，并突出了三价铬（一种生物学必需但尚未充分探索
