《Food Science & Nutrition》：Improvement of Phenolic Compound and Anthocyanin Extraction Efficiency From Clitoria ternatea by Autogenous Pressurization Method in a Sealed-Vessel and Determination of Anthocyanin Compounds by LC-HRMS
编辑推荐：
本研究综述了一种创新的绿色提取技术——自生加压密闭容器提取法（CVE-AP），在优化条件下用于高效富集蝶豆花（Clitoria ternatea L.）中的花色苷（TAC）、总酚（TPC）及提升其抗氧化活性（DPPH）。通过响应面法（RSM）确定了最佳工艺参数，结合SEM、UPLC-UV和LC-HRMS等分析技术，揭示了细胞壁破坏机制与提取物的成分特征。结果表明，CVE-AP较常压提取可显著提升花色苷得率86%，为功能性食品与医药应用提供了高效、可持续的活性成分提取新策略。
引言：蝶豆花与花色苷的价值
蝶豆花（Clitoria ternatea L.）是一种可食用的热带花卉，因其深蓝色泽，被广泛用作天然着色剂，同时也是花色苷和酚类化合物的丰富来源。花色苷是赋予植物红、紫、蓝色调的水溶性类黄酮糖苷，其化学稳定性受酰化和糖基化影响，蝶豆花中的ternatin类花色苷即因其分子内辅色作用而具有出色的色泽稳定性。酚类与花色苷是重要的植物次生代谢物，其抗氧化活性主要通过氢原子转移（HAT）和单电子转移（SET）机制清除活性氧（ROS）。传统提取方法（如浸渍、索氏提取）耗时长、溶剂用量大，因此，绿色高效的提取技术备受关注。
加压提取与CVE-AP技术
加压液体提取（PLE）或加速溶剂萃取通过提高温度和压力来增强溶剂渗透和传质效率，已在多种植物基质的花色苷提取中显示出优势。本研究采用的闭合容器自生加压提取法（Closed-vessel extraction under autogenous pressure, CVE-AP）是一种新兴的绿色替代方案。其核心原理在于，通过在密封容器中加热，利用溶剂蒸汽被动产生内部压力，无需外部加压系统，即可有效增强溶剂扩散和传质。本研究首次将CVE-AP应用于蝶豆花生物活性成分的提取，旨在优化工艺参数，并深入探究其提取机理和产物组成。
材料、方法与实验设计
实验所用新鲜蝶豆花采自越南西宁省，经热泵干燥后用于提取。CVE-AP实验装置为一个置于恒温水浴中的密闭不锈钢容器，内部压力通过压力传感器和布尔登压力计监测。首先进行单因素实验，探究温度（通过调节温度和乙醇浓度间接控制自生压力）、乙醇浓度、提取时间和液固比（L/S）对提取效果的影响。提取物通过福林-酚法测定总酚含量（TPC，以没食子酸当量GAE计），通过pH示差法测定总花色苷含量（TAC，以矢车菊素-3-葡萄糖苷当量C3G计），并通过DPPH自由基清除实验评估抗氧化能力（以Trolox当量TE计）。基于单因素结果，选取自生压力、时间和液固比三个关键因素，采用中心复合设计（CCD）进行响应面法（RSM）优化。实验压力范围通过乙醇-水体系的汽液平衡模型（结合拉乌尔定律、安托万方程和理想气体定律）进行预测和验证，确保操作安全。
结果与讨论
1. 单因素实验揭示关键参数影响
- •
自生压力（Autogenous Pressure）的影响：压力由温度和乙醇浓度共同决定。实验测得压力在~18至40 psi之间，与模型预测一致。如图2所示，随着压力从~18 psi增至~33 psi，TAC、TPC和DPPH值均显著提升。这归因于升高的温度和压力降低了溶剂粘度和表面张力，增加了扩散系数，促进了溶剂向植物基质的渗透。然而，在~40 psi时，各指标出现轻微下降，形成先增后减的趋势。过高温度可能导致花色苷从有色的黄烊盐阳离子向无色的半缩酮和查尔酮形式转化，并加剧热降解和氧化。高乙醇浓度也会降低溶剂极性，不利于带电花色苷的溶解。
- •
提取时间（Extraction Time）的影响：如图3所示，在最初的30分钟内，TAC、TPC和DPPH迅速增加，表明此阶段传质和溶剂渗透占主导。超过30分钟后，尤其是在TAC和DPPH指标上观察到随提取时间延长而逐渐下降，这同样与密闭容器中长时间高温暴露导致的花色苷降解有关。
- •
液固比（Liquid-to-Solid Ratio）的影响：如图4所示，液固比从14:1 mL/g增加至22:1 mL/g时，TAC、TPC和DPPH值显著提高，这得益于固液两相间浓度梯度增大驱动的传质增强。然而，进一步增加溶剂体积并未带来更多收益，反而导致各响应值轻微下降，表明达到萃取平衡后，过量溶剂可能稀释传质效率或共提取出抗氧化贡献较低的成分。
2. RSM优化确定最佳工艺条件
基于单因素实验，采用RSM-CCD对三个关键因素进行建模优化。ANOVA分析表明，自生压力（A）对TAC的影响最为显著（p < 0.0001），其次是液固比（C）和时间（B）。二阶模型具有高度显著性（F = 27.21, p < 0.0001），决定系数R2约为0.96。尽管失拟项显著，但模型在实验域内，尤其是最优区域附近，展现出良好的预测性能。响应面图（图5）清晰显示了各因素的非线性效应及交互作用。模型优化得到的最佳条件为：自生压力28.2 psi，提取时间36分钟，液固比17.6 mL/g（约18:1 mL/g）。在此条件下进行验证实验，结果与预测值无显著差异，测得TAC为2.72 ± 0.18 mg/g干物质，TPC为56.82 ± 2.16 mg GAE/g干物质，DPPH为175.78 ± 6.63 μmol TE/g干物质。与常压提取（TAC 1.46 mg/g干物质）相比，优化后的CVE-AP工艺使花色苷得率提升了86%。
3. 分析技术揭示提取机理与成分特征
- •
扫描电镜（SEM）分析：SEM图像直观展示了提取方式对细胞结构的影响。常压提取的样品（图6a）表皮细胞相对完整，仅有浅沟。而经过CVE-AP处理的样品（图6b）则显示出细胞壁分层、断裂，形成更多孔隙和微裂缝。这种结构破坏与“爆炸-减压”机制一致，即高压溶剂渗透后突然释放压力导致细胞壁基质崩塌，从而增大了有效表面积，缩短了扩散路径，显著促进了活性成分的释放。
- •
超高效液相色谱-紫外（UPLC-UV）分析：UPLC-UV分析定量了提取物中的主要酚类成分。芦丁（rutin）含量最高，达33.38 mg/g粗提物，占总定量酚类的约67.7%。其他成分包括芹菜素、槲皮素、儿茶素、槲皮苷、鞣花酸、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和咖啡因。色谱图（图7）清晰显示了各成分的分离情况。高含量的黄酮醇（尤其是芦丁）与PLE条件能提高非极性化合物回收率的特性相符。
- •
液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）分析：LC-HRMS用于深度鉴定花色苷及相关类黄酮成分。基于精确质量和MS/MS碎片信息，从提取物中初步鉴定了7个与色素相关的类黄酮化合物（表5），包括花色苷和黃酮醇衍生物，例如：delphinidin-3-O-(cis-p-coumaroyl-glucoside)、kaempferol 3-O-(6″-O-p-coumaroyl)-rutinoside、cyanidin-3-O-(p-coumaroyl) glucose、delphinin glucoside等。其中cyanidin-3-O-(p-coumaroyl)glucose的相对丰度最高（32.20%）。总离子流图如图8所示。这些鉴定结果与蝶豆花已知的化学成分特征一致，证实了CVE-AP在有效提取这些活性成分的同时，能较好地保持其化学结构。
结论与展望
本研究成功验证了闭合容器自生加压提取法（CVE-AP）作为一种高效、绿色的技术，用于从蝶豆花中提取花色苷和酚类化合物的可行性。通过系统优化，确定了最佳工艺参数，使花色苷得率相较常压提取大幅提升86%。SEM观察从微观层面证实了压力导致的细胞壁破坏机制，而UPLC-UV和LC-HRMS分析则从成分层面揭示了提取物丰富且特征明确的酚类与花色苷谱。CVE-AP技术因其设备简单（无需外部加压）、工艺可重复性好且易于放大，在从天然植物资源中高值化提取生物活性成分方面展现出巨大潜力，为功能性食品、营养保健品和天然着色剂的应用开发提供了新的科学依据和技术路径。未来的研究可进一步探索更广的压力操作范围、化合物的长期稳定性、中试规模的工艺性能及工业化的经济可行性。
