《Food Science & Nutrition》：Ying-Huang Oral Liquid Ameliorates Oxidative Stress in the Liver of Heat-Stressed Broilers via KEAP1-NRF2 and PINK1/Parkin Pathway
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本研究揭示，热应激（HS）显著损害肉鸡肝脏功能与生长性能。银黄口服液（YOL）能通过上调Sirt1蛋白，进而激活NRF2–KEAP1抗氧化通路与PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，并调节GPX4/SLC7A11抑制铁死亡，从而多靶点缓解热应激诱导的肝脏氧化损伤，为养殖业提供了一种基于传统方剂的潜在肝脏保护策略。
文章内容归纳
引言
全球家禽产业正面临气候变化导致的温度波动、禽产品需求增长及传染病传播等多重挑战。家禽因被覆浓密羽毛且缺乏功能性汗腺，在高温环境下体温调节能力有限，而现代集约化养殖模式进一步加剧了其热应激（HS）易感性。热应激会显著损害生长性能、饲料效率、繁殖力及存活率，并对全球禽类蛋白供应的稳定性构成威胁。此外，热应激诱导的免疫抑制增加了疾病易感性，引发更多食品安全担忧。
为缓解热应激的不利影响，已发展出管理、遗传和营养等多种策略。其中，营养策略，特别是草药添加剂，因其成本低、安全性高、无残留及多样化的生物活性而颇具前景。热应激会在禽类中诱发明显的肝损伤，其特征是过度的氧化应激和炎症，最终破坏代谢稳态。因此，靶向肝脏功能障碍的中草药（TCM）可能是一种有前景的预防和治疗策略。
银黄口服液（YOL）源于国家标准兽药汇编中收录的“茵栀解毒颗粒”，由茵陈、栀子、黄芩、虎杖、钩藤等组成，是少数正式批准的保肝制剂之一。本研究旨在评估YOL对热应激的潜在保肝作用，并阐明其保护作用的分子机制。
材料与方法
研究使用120只2周龄SPF健康雄性麻鸡，在环境控制室适应7天后，随机分为6组：对照组（23°C±2°C）、模型组（HS，35°C±2°C，每天8小时，持续7天）、阳性药组（HS+维生素C，60 mg/kg）及三个YOL治疗组（YOL-H，10 g/kg；YOL-M，5 g/kg；YOL-L，2.5 g/kg）。热应激开始1小时后，鸡只灌胃给予维生素C或YOL。实验结束时，记录生长性能指标，采集肝脏样本进行组织病理学、超微结构、生化及分子生物学分析。
实验方法包括：肝脏铁含量和谷胱甘肽（GSH）含量测定、肝脏组织病理学（H&E染色）和透射电子显微镜（TEM）分析、网络药理学与分子对接分析，以及蛋白质印迹法（Western Blot）检测相关蛋白表达。数据以均值±标准差表示，并使用GraphPad Prism进行统计分析。
结果
1. YOL改善热应激肉鸡的生长性能
与对照组相比，模型组的终末体重、平均日采食量（ADFI）和平均日增重（ADG）均显著降低，而料重比（FCR）显著升高。YOL-L和维生素C的补充有效降低了模型组的FCR。YOL-L和维生素C组的ADG与模型组相比有显著提高。
2. YOL减轻热应激肉鸡的肝脏病理变化
对照组肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐。热应激肉鸡在中央静脉周围表现出明显的炎性细胞浸润（红色三角指示）。这种浸润在维生素C、YOL-M和YOL-H组中消失，而YOL-L组仍有轻度门脉区浸润。中、高剂量YOL治疗有效防止了中央静脉相关的炎性浸润，提示其剂量依赖性的肝脏保护作用。
3. YOL上调热应激肉鸡肝脏中的NRF2-KEAP1信号通路
与对照组相比，模型组总P62蛋白表达无变化，但磷酸化P62（p-P62）及p-P62/P62比值显著降低。YOL补充显著降低了P62表达，同时增加了p-P62/P62比值。热应激还升高了KEAP1表达，并显著抑制了NRF2及其下游抗氧化蛋白HO-1的表达。维生素C处理部分缓解了这些变化。相比之下，YOL给药显著下调了KEAP1，上调了NRF2、NQO1和HO-1的表达。这些结果表明，YOL显著激活了热应激肉鸡肝脏的NRF2–KEAP1信号通路。
4. YOL调控热应激的核心成分与靶点
网络药理学分析构建了一个包含70个节点和495条边的蛋白质相互作用（PPI）网络。经过筛选得到一个包含9个节点和30条边的核心子网络。去乙酰化酶Sirt1表现出较高的中介中心性和适中的度值，表明其是网络中的关键桥梁节点。其他核心靶点包括CASP3、BCL2和STAT3。排名前4的化合物包括黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷和金合欢素。分子对接结果显示，这四种化合物与Sirt1的变构位点均表现出高结合亲和力，预测结合能均低于-7 kcal/mol，且每种配体在其最佳结合构象中与Sirt1形成了至少两个氢键。
5. YOL增强热应激肉鸡肝脏中铁死亡相关蛋白的表达
热应激显著增加了肝脏铁含量，并上调了Sirt1蛋白表达。与模型组相比，维生素C显著增强了GSH水平，上调了Sirt1和GPX4表达，但下调了SLC7A11表达。相比之下，YOL显著增强了GSH水平，增加了Sirt1、GPX4和SLC7A11的表达，表明其促进了铁死亡相关蛋白的表达。
6. YOL缓解线粒体形态异常，并促进热应激肉鸡肝脏中的PINK1/Parkin信号通路
对照组细胞核膜清晰，呈典型双层结构。细胞器轮廓分明，内质网呈清晰的管状形态，线粒体呈卵圆形或短棒状，膜完整，嵴结构整齐。热应激诱导了内质网扩张和自噬溶酶体形成减少。此外，线粒体超微结构被显著破坏，其特征是嵴断裂并大部分消失，膜完整性部分丧失，线粒体形态不规则。YOL-L在很大程度上恢复了大部分线粒体的嵴结构。在维生素C、YOL-M和YOL-H组中，线粒体嵴清晰可见，观察到自噬溶酶体，并且在低剂量YOL处理中明显的内质网扩张在高剂量YOL处理下消失。
与对照组相比，热应激显著增加了PINK1表达并降低了Parkin蛋白表达。维生素C处理显著上调了PINK1和Parkin表达。维生素C和YOL恢复了PINK1水平，并显著上调了Parkin表达，表明这些干预措施可能部分或完全恢复热应激下的PINK1/Parkin信号通路。
讨论
肝脏健康对维持家禽最佳生产性能至关重要。本研究中，热应激诱导了肝脏中央静脉周围的炎性细胞浸润，并通过降低ADFI和ADG抑制了生产性能，同时增加了FCR。补充维生素C和YOL-L有效缓解了热应激引起的生长抑制。
热应激诱导的肝损伤与氧化应激密切相关。KEAP1-NRF2轴是细胞抗氧化防御的核心调节器。本研究证实，热应激损伤了KEAP1-NRF2抗氧化轴，而YOL明显缓解了这种损伤。YOL与维生素C的作用靶点存在根本区别：维生素C直接增强NRF2水平，而YOL则通过激活p62来增强KEAP1-NRF2抗氧化轴。
肝脏是铁储存的主要器官，特别容易受到铁驱动的氧化损伤。本研究中，热应激显著增加了肝脏铁水平，表明热应激诱导的家禽氧化损伤可能与铁积聚有关。网络药理学分析将去乙酰化酶Sirt1确定为中枢枢纽蛋白。分子对接分析进一步揭示，YOL的活性成分与Sirt1的变构口袋表现出良好的结合，提示了Sirt1激活的潜在机制。这一预测得到了实验数据的证实，YOL处理显著上调了肝脏Sirt1表达。热应激显著降低了GPX4和SLC7A11的表达，表明内源性抗氧化防御受损促进了铁死亡性细胞死亡。维生素C部分恢复了Sirt1和GPX4的表达，证实了其抗氧化活性，但在信号通路层面的参与有限。相比之下，YOL激活了NRF2和Sirt1，并恢复了SLC7A11和GPX4的表达。这些发现表明，YOL增强了肝脏抗氧化能力，这可能与铁死亡的减轻有关。
线粒体形态与铁死亡的调节密切相关。本研究中，热应激诱导线粒体超微结构显著损伤，包括嵴断裂和消失，从而证实了严重的线粒体损伤。线粒体自噬是线粒体质量控制的关键补偿机制，其中PINK1作为线粒体损伤传感器，Parkin作为下游效应器。先前研究发现，通过PINK1/Parkin依赖性途径可以增强线粒体自噬，从而缓解热应激诱导的肉鸡细胞损伤。与线粒体损伤信号的激活一致，热应激组表现出PINK1表达升高伴随Parkin水平降低。YOL恢复了线粒体嵴的完整性并增加了自噬溶酶体的形成，表明其能够改善热应激诱导的线粒体结构损伤并促进自噬清除。此外，YOL逆转了热应激介导的PINK1和Parkin表达的抑制。这些发现表明，YOL通过激活PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬来缓解氧化应激及相关肝损伤，从而改善线粒体超微结构并促进受损细胞器的清除。
结论
YOL通过激活Sirt1，协调KEAP1/NRF2介导的抗氧化防御、GPX4/SLC7A11依赖的铁死亡抑制以及PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，从而发挥多靶点肝脏保护作用，减轻热应激诱导的氧化性肝损伤。
