《Microchemical Journal》：Determination of vitamin K
1 in leafy green foods by liquid chromatography with electrochemical detection utilizing the voltammetric behavior of quinones in an acidic protic solvent
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本研究开发了一种基于酸性 protic 溶剂中维生素K1还原电位正移的HPLC-ECD检测方法，无需复杂氧去除或预柱系统，成功应用于菠菜、绿汁粉等绿叶食品及饮品的VK1定量分析，结果准确可靠。
川久保美咲 | 小谷明良 | 松田浩一 | 宫家勝則 | 清泽彩 | 山本和宏 | 横又秀树
东京药科大学药学院，日本东京八王子市堀之内1432-1，邮编192-0392
摘要
本研究利用醌类化合物在酸性质子溶剂中的还原电位正移现象，结合高效液相色谱（HPLC）技术，用于测定绿叶蔬菜中的维生素K1（VK1）含量。在HPLC-ECD系统中，采用十八烷基修饰的硅胶柱作为固定相，流动相为含有5 mM HCl和10 mM LiClO4的乙醇-甲醇（50:50，v/v）混合液。使用裸露的玻璃碳工作电极，在?0.2 V（相对于Ag/AgCl）的电位下检测VK1。VK1的峰电流与内标物质menaquinone-4的峰电流之比在0.149–22.5 mg/L范围内呈线性关系，相关系数（r）为0.998。该HPLC-ECD系统成功应用于菠菜、青汁粉和桑叶茶粉等绿叶蔬菜中VK1的定量分析，获得了准确且精确的结果。
引言
维生素K1（VK1；图S1）主要存在于绿叶蔬菜中[1]，[2]，在凝血因子（II、VII、IX和X）以及与骨骼相关的蛋白质骨钙素[3]、[4]的合成中起着关键作用。
VK1与广泛使用的口服抗凝剂华法林之间的药物-营养相互作用已得到充分研究[5]。华法林通过抑制维生素K环氧还原酶复合物（VKOR），阻碍还原型维生素K的再生，从而影响维生素K依赖性凝血因子的γ-羧化过程[6]、[7]、[8]。因此，饮食中VK1的摄入量会显著影响华法林的抗凝效果[7]、[8]、[9]、[10]。对于VK1摄入量低于250 μg/d的患者，维持剂量为3.5 ± 1.7 mg/d；而摄入量超过250 μg/d的患者则需要更高的剂量（5.7 ± 1.7 mg/d）[11]。此外，在华法林治疗期间，如果患者前四天内维生素K摄入量每增加100 μg，国际标准化比率（INR，用于监测维生素K拮抗剂治疗效果的参数）大约会降低0.2[12]、[13]。即使维生素K摄入量较低（如100 μg/d或150 μg/d），也观察到INR值下降[14]、[15]。尽管大多数患者能够实现稳定的抗凝效果，但仍有一小部分患者的INR值会因监测和剂量调整不当而出现波动。因此，准确测定绿叶蔬菜（包括深绿色蔬菜及相关饮品）中的VK1含量对于确保华法林治疗的顺利进行至关重要。
为了测定食品和饮料样本中的VK1含量，已有多种检测方法（如紫外光谱、荧光、电化学和常压化学离子化质谱APCI-MS）与高效液相色谱（HPLC）结合使用[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。在荧光检测（FL）方法中，会在荧光检测器上游设置电解还原预柱系统（使用锌或铂电极），通过电化学还原将VK1转化为氢醌（在240 nm处激发、430 nm处发射荧光）来进行测量[18]、[19]、[20]。由于VK1可被电化学还原，因此可以直接使用HPLC与电化学检测（HPLC-ECD）在?1.0 V电位下进行测定[21]。然而，在如此负的电位下，流动相中的溶解氧也会被同时还原，从而干扰色谱测量中的还原电流。为了减少溶解氧的影响，通常需要在色谱测量过程中持续用氩气冲洗流动相。也有报道指出，在电化学检测器上游设置电解还原预柱的HPLC-ECD系统[22]。在这些系统中，VK1首先在电解还原预柱中被还原为氢醌，随后在下游的电化学检测器处被氧化，从而通过氧化电流测定其含量。因此，开发一种无需复杂除氧程序或电解还原预柱的简单HPLC-ECD方法仍是一个挑战。
基于研究发现（3,5-叔丁基-1,2-苯醌等醌类化合物在酸性质子溶剂中的还原电位比在中性质子溶剂中更正），我们开发了一种基于伏安法的检测方法[23]、[24]。基于这些伏安行为，我们推测可以开发一种无需复杂除氧程序或电解还原预柱的简单HPLC-ECD系统，在接近0 V（相对于Ag/AgCl）的电位下测定VK1。本研究报道了使用酸性质子溶剂作为流动相的HPLC-ECD系统用于VK1测定的方法，并通过实际样品分析验证了该系统的适用性，包括深绿色蔬菜及青汁和桑叶茶粉等饮品。
化学试剂与材料
乙醇、甲醇、正己烷、高氯酸锂（LiClO4）和维生素K1均属于分析级试剂，购自富士菲尔茂纯化学公司（日本大阪）。内标物质menaquinone-4（维生素K2；图S1）购自东京化学工业公司（日本东京）。
样品
本研究使用的实际样品为市售菠菜和Komatsuna（日本芥菜菠菜，学名：Brassica rapa L. var. perviridis L.H.）
酸性质子溶剂中VK1还原峰电位的正移
使用计算机控制的电化学系统，在含有50 mM LiClO4的乙醇-甲醇（50:50，v/v）混合液中记录了0.5 mM VK1的伏安图。如图1A（实线黑色曲线）所示，VK1在?0.74 V（相对于Ag/AgCl）处出现明显的还原峰。随后，在含有5 mM HCl的条件下再次记录VK1的伏安图，如图1B（实线黑色曲线）所示，VK1在?0.22 V（相对于Ag/AgCl）处出现明显的还原峰。
结论
利用醌类化合物在酸性质子溶剂中的伏安行为，我们开发了一种简单的电化学检测方法，能够在接近0 V（相对于Ag/AgCl）的电位下测定VK1。该电化学检测方法与HPLC结合使用，成功应用于深绿色蔬菜及相关饮品中VK1的测定。实际样品分析表明，HPLC-ECD系统能够提供准确且精确的VK1定量结果。
作者贡献声明
川久保美咲：撰写初稿、验证、方法学设计、实验实施、数据整理。小谷明良：审稿与编辑、撰写初稿、资源获取、项目管理、方法学设计、实验实施、概念构思。松田浩一：验证、数据分析。宫家胜则：监督工作、资源协调。清泽彩：方法学设计、数据分析。山本和宏：监督工作、资源协调。横又秀树：审稿与编辑、监督工作
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
