综述：基于CRISPR/Cas12a的生物传感器在乳制品中检测病原菌的应用：综述

《Microchemical Journal》：CRISPR/Cas12a-based biosensors for the detection of pathogenic bacteria in dairy products: A comprehensive review

乳制品因营养丰富易滋生病原菌，需快速精准的现场检测技术。CRISPR/Cas12a biosensors因高灵敏度和可编程性成为理想工具，但乳基质中脂肪、蛋白质及离子干扰导致检测效率下降。本文系统综述了荧光、比色及电化学等不同传感模式对复杂基质的适应性改进，重点探讨微流控芯片、侧流试纸和智能手机集成平台的设计优化，提出通过靶向探针修饰、表面功能化处理及信号放大策略克服干扰，为开发实用型乳品安全监测系统提供理论指导。

　　

孙书霞|余颖|熊志强|宋欣|艾连忠

上海工程技术大学健康科学与工程学院食品微生物学研究中心，中国上海200093。

摘要

乳制品极易受到病原菌的污染，因此需要快速、准确且能够在现场进行的检测方法。基于CRISPR/Cas12a的生物传感器因其高灵敏度、特异性和可编程性而成为有前景的工具。然而，它们在乳制品中的应用面临独特挑战，包括脂肪、蛋白质和离子的干扰，以及需要简化适用于现场操作的工作流程。本综述系统分析了最近在乳制品病原体检测方面CRISPR/Cas12a生物传感器的进展，重点关注乳制品特有的挑战及相应的解决方案。综述总结了荧光、比色和电化学生物传感器，并强调了它们对复杂乳制品环境的适应性。此外，我们还讨论了集成便携式平台（如微流控技术、侧向流动检测法和基于智能手机的系统）在现场应用中的潜力。本文为开发强大且可在现场部署的生物传感系统提供了可行的见解和未来发展方向，以提升乳制品的安全监测。

引言

作为全球饮食的重要组成部分，乳制品是高质量蛋白质、钙、维生素和矿物质的重要来源，这些成分对维持骨骼健康和促进生长发育至关重要[1]，[2]。然而，乳制品丰富的营养成分为微生物的生长和繁殖提供了理想的环境，从而在整个从农场到餐桌的产业链中带来了病原体污染的风险，包括原材料运输、加工、储存、包装和销售环节[3]，[4]，[5]（见图1）。常见的食源性病原体如沙门氏菌 [6]、金黄色葡萄球菌（S.aureus）[7]、单核细胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）[8]以及某些致病性大肠杆菌菌株是威胁乳制品安全和公共卫生的主要因素[9]，[10]，[11]。此外，乳制品复杂的成分组成也会影响检测过程[12]，[13]，[14]：其中的脂肪颗粒和酪蛋白胶束可能通过物理屏蔽或非特异性吸附抑制Cas12a蛋白和扩增酶的活性；高浓度的钙离子可能与酪蛋白形成复合物，包裹细菌细胞或释放的核酸，从而影响核酸的提取；而丰富的背景微生物群会增加假阳性或假阴性结果的风险。为应对乳制品安全方面的严峻挑战，目前的检测方法主要依赖于一系列传统技术。虽然微生物培养方法作为金标准能够提供可靠的结果，但它们繁琐且耗时，无法满足现代食品工业对及时性的要求[15]，[16]。仪器分析技术（如色谱-质谱联用）能够实现精确定量，但设备成本高昂且操作流程复杂[17]。近红外（NIR）和拉曼光谱等光谱技术能够实现快速、无损的筛查[18]，[19]，但它们在复杂基质中容易受到干扰，且通常缺乏足够的灵敏度和特异性来检测低浓度的病原体。传统的免疫测定技术（如ELISA）和分子生物学方法（如PCR）显著提高了检测灵敏度和特异性。然而，在分析复杂的乳制品时，它们的性能会受到基质抑制效应的影响，并且严重依赖于繁琐的样品预处理和专门的实验室环境[20]，[21]，[22]，[23]，[24]。因此，现有的检测技术无法同时满足速度、简便性、稳健性和成本效益的要求，特别是在原始牛奶接收筛查和实时生产监控等关键现场应用中。因此，开发能够直接快速适应复杂基质、同时具备高灵敏度、特异性和优异现场适用性的新型检测技术已成为确保乳制品安全和提高监管效率的迫切需求。（见表1。）

近年来，源自古菌和细菌适应性免疫机制的CRISPR/Cas（规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白）系统作为一种基因编辑工具应运而生，成为分子检测的强大工具。它通过引导RNA（gRNA）介导的目标识别和Cas核酸酶的切割活性发挥作用[25]，[26]，[27]。其中，CRISPR/Cas12a系统因其独特的跨切割活性而在生物传感方面展现出巨大潜力[28]，[29]，[30]，[31]，[32]。在识别并切割特定目标DNA（顺式切割）后，这种酶可以被激活以非特异性地降解周围的单链DNA，从而将特定的识别事件转化为可放大的检测信号[33]，[34]，[35]，[36]，[37]，[38]。CRISPR驱动的核酸检测平台的出现为临床、环境和食品安全领域中快速、灵敏和特异性地识别病原微生物提供了强有力的方法[39]。利用CRISPR/Cas12a系统的可编程性和精确性，这些平台能够以高灵敏度和特异性检测病原体，充分利用CRISPR引导的核酸靶向所固有的分子识别和切割机制[40]，[41]。成熟的基于CRISPR/Cas12a的核酸检测平台（如DNA内切酶-靶向CRISPR报告系统（DETECTR）已被广泛采用，这些系统通常使用荧光或比色报告机制来生成可检测的信号[42]，[43]。此外，CRISPR技术在食品安全分析中的应用也受到了关注。例如，孙等人使用基于CRISPR/Cas12a的侧向流动检测法识别牛奶中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[44]。同样，徐等人开发了利用纳米抗体捕获和CRISPR/Cas12a在牛奶中高灵敏度检测肠炎沙门氏菌的方法[45]。这些研究突显了基于CRISPR的方法在快速准确筛查食源性病原体方面的潜力，这对推进食品安全监测至关重要。

尽管CRISPR/Cas12a系统在病原体检测方面显示出巨大潜力，但现有文献主要集中在其分子机制的演变和信号转导策略的多样性上。在将这项技术应用于特定复杂食品基质（尤其是乳制品）时，系统分析其面临的独特挑战及相应适应性方面仍存在明显不足[46]，[47]。乳制品中高含量的脂质、蛋白质和离子成分不仅可能抑制CRISPR介导的反应效率，还对检测技术的灵敏度、特异性和现场适用性提出了更高要求[12]，[48]。为此，本综述综合了最近在乳制品中基于CRISPR/Cas12a检测病原体的进展，特别关注了如何通过传感器设计、材料集成和设备开发来解决基质干扰、便携性需求和实际实施障碍。通过建立一个结构化的“挑战-解决方案”框架，本综述旨在为开发稳健的、适用于现场的下一代乳制品安全监测平台提供概念性见解和实际指导。

系统搜索和筛选方法

为了确保本综述的全面性和代表性，使用Web of Science、PubMed和ScienceDirect数据库进行了系统的文献搜索。搜索范围涵盖了2015年（Cas12a首次应用于检测的年份）至2025年的出版物。应用的关键词组合包括：（“CRISPR” OR “Cas12a”）AND （“biosensor” OR “detection”）AND （“dairy” OR “milk” OR “yogurt”）AND （“pathogen” OR “bacteria”）。文献选择遵循

CRISPR/Cas12a系统及其机制

CRISPR/Cas12a（以前称为Cpf1）属于第2类V型CRISPR/Cas系统，作为一种RNA引导的内切酶，能够进行序列特异性的DNA识别和切割[33]，[42]，[49]，[50]。与广泛研究的Cas9不同，Cas12a识别的是目标序列上游富含胸腺嘧啶的PAM序列——通常是5’-TTTN（V = A、C或G）[36]，[37]，[51]。这一特性扩大了可靶向的基因组位点范围，并增强了在AT富集区域中的检测灵活性。

基于CRISPR/Cas12a的生物传感器在乳制品病原体检测中的应用

乳制品（如牛奶、酸奶和奶酪）由于其复杂的成分组成（包括高水平的蛋白质、脂肪、乳糖和各种离子[76]）而带来了显著的检测挑战。这些成分可能抑制酶活性，导致核酸探针的非特异性吸附，掩盖目标细菌或产生背景信号。因此，开发适用于乳制品应用的基于CRISPR/Cas12a的传感器不仅需要高灵敏度

便携式和智能集成系统

理想的乳制品安全监测应涵盖整个产业链，从原始牛奶接收和过程质量控制到最终产品发布。这要求检测技术具备现场适用性、快速性和用户友好性，以替代耗时的实验室标准方法。便携式CRISPR/Cas12a生物传感器已成为满足这一需求的研究热点[113]，[119]。然而，将其成功转化为实际应用仍面临挑战

总结与展望

基于CRISPR/Cas12a的生物传感器代表了一种新兴的技术平台，在监测乳制品中的病原菌方面展现出巨大潜力。这些系统结合了CRISPR/Cas12a的精确识别能力和生物传感平台的快速响应特性，能够高效检测多种乳制品来源的病原体，同时有助于早期识别和控制食品安全风险。本综述系统地探讨了

资助致谢

本工作得到了国家自然科学基金（资助编号：32402043）、国家重点研发计划（2024YFD2100900）、国家自然科学基金（重点项目：U22A20550）以及云南省特色水果应用技术重点实验室项目（资助编号：202305AG070001）的支持。

作者贡献声明

孙书霞：撰写——原始草稿，数据整理。余颖：撰写——审稿与编辑，监督，概念构思。熊志强：形式分析，概念构思。宋欣：监督，资金获取。艾连忠：监督，资金获取。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。