《Food Frontiers》：Modulation of in Vitro Digestibility and Bioaccessibility in Aging-Related Gastrointestinal Models: Effects of Pork Processing Methods
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本研究通过体外静态消化模型模拟健康成人与老龄胃酸缺乏（EA）人群胃肠道环境，系统探究了低真空烹饪（SV）、油炸（FR）和烘烤（RO）三种加工方式对猪肉蛋白质消化、肽谱形成、游离氨基酸（FAA）释放及Caco-2细胞模型吸收的影响。结果发现，EA条件显著削弱蛋白质消化效率，SV加工能生成最多数量、最小长度的肽段，其产生的游离氨基酸和可吸收肽含量最高，并表现出最强的抗氧化活性。研究表明，低真空烹饪是应对老龄化人群消化吸收障碍、提升猪肉营养价值的有效策略。
引言
全球老龄化加速，预计到205年，65岁以上人口将占全球总人口的六分之一。衰老伴随着胃肠（GI）功能退化，其中胃酸缺乏（EA）是老年人中常见的消化障碍，可导致营养吸收不良及相关慢性疾病。猪肉是优质蛋白质来源，但加热加工方式会影响其最终消化和营养价值。本研究旨在评估低真空烹饪、油炸和烘烤三种常见加工方式，在模拟健康成年人（对照）和老龄胃酸缺乏（EA）人群的两种体外胃肠道条件下，对猪肉蛋白质消化、肽谱形成、游离氨基酸释放及肠道吸收的影响，以期为老龄人群提供优化的膳食建议。
材料与方法
实验使用猪背最长肌，经修剪后分别进行低真空烹饪、油炸和烘烤处理，均处理至内部温度达72°C。随后冻干、研磨成粉。体外消化依据INFOGEST静态消化模型改进，设置了对照条件（胃相pH 3.0，胃蛋白酶2000 U·mL?1，胆汁10 mM，胰酶100 U·mL?1，肠相2小时）和EA条件（胃相pH 6.0，胃蛋白酶1500 U·mL?1，胆汁5 mM，胰酶50 U·mL?1，肠相4小时）。消化过程在不同时间点取样，用于后续分析。
使用SDS-PAGE监测消化过程中的蛋白质谱带变化，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察消化物微观结构，氨基酸分析仪测定游离氨基酸含量，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行非标记肽谱分析。此外，建立Caco-2细胞单层模型来模拟肠道吸收，测定基底外侧腔中的肽和FAA浓度，并使用ABTS试剂盒评估抗氧化能力。
结果与讨论
SDS-PAGE
消化过程中，高分子量蛋白质条带逐渐减弱或消失，低分子量（< 5 kDa）肽条带在后期占主导。在相同时间点，EA条件下的高分子量条带强度高于对照条件，表明EA条件下消化减弱。SV组的肌球蛋白重链（~270 kDa）在对照条件下120分钟几乎消失，但在EA条件下仍可见。肠相中，对照条件下120分钟时的小分子条带强度低于EA条件下120分钟和240分钟。在EA条件下，三种加工方式间的差异在肠相变得明显，SV组的小分子条带强度显著低于FR和RO组，且35-50 kDa的条带在SV组消失得最快。这可能是由于不同加工温度诱导的蛋白质氧化聚集程度不同所致，SV处理温度较低，蛋白质修饰较轻，更利于酶解。
微观结构
CLSM图像显示，从胃相到肠相，消化物中可见的蛋白质颗粒数量和大小逐渐减少。在胃相，EA条件下观察到的蛋白质颗粒数量和尺寸均大于对照条件，表明胃相消化不充分。在肠相，对照条件下120分钟时蛋白质颗粒的尺寸已非常小，而在EA条件下，即使到240分钟，仍有较多小尺寸蛋白颗粒。在EA条件下，肠相120分钟时，SV组的蛋白颗粒数量最少，RO组的颗粒尺寸最大，这一差异持续到240分钟。这说明在EA条件下，SV组的消化最为彻底。
肽谱分析
肽段鉴定总数显示，SV组（9594个）高于FR组（9150个）和RO组（8783个）。在胃相，SV组在对照和EA条件下鉴定出的共享肽段数量最高（1447个），在肠相共享肽段比例也最高（33.9%），表明GI条件变化对SV组肽段释放的影响最小。
肽段长度分布显示，随着消化从胃相进入肠相，较长肽段（17-20和12-16个氨基酸）比例下降，而较短肽段（7-11和3-6个氨基酸）比例略有上升。EA条件下低分子量肽段的比例低于对照条件，表明其蛋白水解过程有所减弱。主成分分析（PCA）和相关性分析进一步证实，肠相消化结束时，SV组在对照（I-C-120）和EA（I-E-240）条件下的肽段分布在第二主成分上距离最近，相关性系数最高（0.8159）。热图分析显示，在胃相和肠相，无论EA还是对照条件，SV组3-6个氨基酸长度肽段的强度显著高于FR和RO组，而17-20个氨基酸长度肽段的强度显著低于后两者。这些结果一致表明，SV加工能够生成最多数量、最小长度的肽段，且在模拟老龄消化环境下仍能保持相对稳定的肽谱，可能是更适合老年人的猪肉加工方式。
游离氨基酸
在胃相，EA条件下的总FAA含量显著低于对照条件。在肠相，对照条件下120分钟时的总FAA含量仍显著高于EA条件。无论是对照还是EA条件，SV组在肠相120分钟时的总FAA含量均显著高于FR和RO组。在肠相EA条件下240分钟时，三种加工方式的总FAA含量无显著差异。个体氨基酸分析显示，在胃相EA条件下，SV组的苯丙氨酸（Phe）水平显著高于FR和RO组。在肠相，SV组的苏氨酸（Thr）和亮氨酸（Leu）等必需氨基酸水平在两种消化条件下均显著高于FR和RO组。这表明SV加工有助于提高必需FAA的有效性，对老龄人群营养更有益。
Caco-2细胞转运实验
肽和FAA浓度
Caco-2单层模型转运实验显示，在两种消化条件下，SV组在基底外侧腔中的肽和FAA浓度均显著高于FR和RO组。同时，EA条件下的FAA和肽浓度均显著低于对照条件。这表明SV加工产物具有更高的肠道吸收潜力，而EA条件会减弱营养吸收。
ABTS测定
抗氧化能力测定结果显示，在两种消化条件下，SV组转运后消化物的ABTS自由基清除活性均显著高于FR和RO组，表现出最强的抗氧化能力。EA条件下的总体抗氧化值显著低于对照条件，表明与年龄相关的GI条件变化会损害生物活性化合物的生物利用度。
结论
这项体外消化研究表明，EA条件显著影响了三种不同加工方式处理的猪肉蛋白质消化。随着消化从胃相推进到肠相，对照与EA条件之间的差异逐渐减小。在三种加工方式中，SV处理展现出显著优势：其在消化终点显示出更少的高分子量蛋白质条带和更小的蛋白质颗粒；生成肽段的总数最多，小分子量肽段强度最强；游离氨基酸释放量更高；并且在Caco-2转运模型中，其产物具有最高的肽和FAA吸收浓度以及最强的抗氧化活性。这些结果强调了优化食品加工方法以适应老龄化人群生理机能下降的必要性。总之，低真空烹饪是开发适合老年人群的蛋白质富集食品的一种有前景的策略，在提升蛋白质消化率和营养素生物利用度的同时，有望保持产品的感官品质，在老年友好型或功能性肉制品设计中具有广阔应用潜力。未来需要进一步的研究，特别是在体内验证这些结论的适用性。
