《JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》：Emerging Contaminants in Raw and Cooked Marine Mussels: The QuEChERS Approach Combined With High-Performance Liquid Chromatography Coupled With Tandem Mass Spectrometry
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本研究利用QuEChERS提取技术，结合高效液相色谱-串联质谱（HPLC–MS/MS）分析方法，对地中海贻贝（Mytilus galloprovincialis）生样与熟样中的新型污染物（ECs）进行了系统筛查与定量分析。研究发现，咖啡因和多种紫外线吸收剂是主要污染物，且煮沸处理后污染物浓度普遍升高。该工作为评估人类通过食用海产品摄入污染物的潜在风险提供了有价值的数据基础，并首次探究了烹饪过程对贻贝中多种ECs浓度的影响。
引言
全球水产养殖业，特别是贻贝、蛤、扇贝和牡蛎等带壳软体动物的养殖，在过去几十年中经历了显著增长。贻贝因其滤食习性，能够从其周围环境中累积多种外源性化合物，从而成为反映环境污染物状况及潜在人体暴露风险的有效生物指示器。然而，贻贝组织高脂高蛋白的特性（脂质含量高达17%，蛋白质高达27%）也给污染物分析带来了挑战，可能导致显著的基质效应，因此需要严格的样品前处理程序。本研究旨在应用优化的QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe）提取方法，结合高效液相色谱-串联质谱（HPLC–MS/MS）技术，调查生、熟地中海贻贝（M. galloprovincialis）样品中新型污染物（ECs）的存在情况。样本采集自供应意大利利古里亚地区鱼市场的三个不同水产养殖场（分别位于利古里亚、撒丁岛和西班牙），以期提供不同地理来源污染状况的代表性概览。此研究首次探究了烹饪对贻贝中不同类型ECs浓度的影响，反映了其真实消费条件。
材料与方法
本研究检测的18种目标分析物包括：紫外吸收剂如桂皮酸盐（EHMC）、苯酮-3（BP-3）、辛基二甲基对氨基苯甲酸（OD-PABA）、奥克立林（OC）、水杨酸乙基己酯（EHS）；药物如卡马西平（CBZ）、氢氯噻嗪（HCTZ）、美托洛尔（MTPL）、克伦特罗（CLBT）、氯霉素（CMPH）；全氟化合物如全氟辛酸（PFOA）和全氟辛烷磺酸（PFOS）；以及其他污染物如咖啡因（CAFF）、三氯生（TCS）、奥美酸盐（OMT）、茶碱（THB）、双氯芬酸（DCF）和蔗糖素（SCL）。所有标准品纯度均≥97%。
分析方法基于LC–MS/MS平台，采用动态多反应监测（d-MRM）模式以增强选择性和灵敏度。色谱分离使用反相色谱柱完成。样品前处理采用改良的QuEChERS方法：将100mg贻贝组织用乙腈/水（50:50, v/v）混合溶液提取，加入硫酸镁（MgSO4）和氯化钠（NaCl）盐析，离心分层后取上清液进行分散固相萃取（d-SPE）净化，使用PSA和C18吸附剂去除干扰物。净化后的提取物经氮吹浓缩、复溶、过滤后进行分析。
方法学验证评估了线性范围、基质效应（ME%）、检出限（LOD）和定量限（LOQ）。校准曲线浓度范围为0.1至50 ng/mL。大部分分析物的基质效应在79%-109%的较优范围内，仅双氯芬酸（DCF）略低（74%），但因其在所有样本中均未检出，故定量分析仍采用外标法。
样本采集、合并与储存
样本于2024年9月从当地鱼市购得，分别源自三个地区：利古里亚（意大利）、撒丁岛（意大利）和西班牙。每个地理来源的贻贝被分为两组：一组用于生样分析，另一组用于煮熟处理。熟样在模拟家庭烹饪条件下用锅具煮沸。最终，共制备了36个合并样品，每个样品由5个个体的组织合并而成，具体包括每个地区的6个生样合并样和6个熟样合并样。
结果与讨论
环境样本分析结果
在分析的18种分析物中，有10种在任何样本中均未检出，包括THB、OMT、MTPL、CLBT、HCTZ、SCL、CMPH、PFOS、DCF和TCS。在检出的污染物中，紫外吸收剂是其中最为普遍的污染物类别。具体而言，OD-PABA是检出最广泛的紫外吸收剂，浓度范围在7至2044 ng/g之间。EHS仅在部分样品中可定量，最高浓度为546 ng/g。OC和EHMC的浓度较高（分别为626 ng/g和592 ng/g），但检出频率较低。BP-3浓度最低（71 ng/g），且仅在一个样本中检出。
咖啡因是另一个被广泛检出的污染物，其浓度在所有定量分析物中最高，范围在163至2672 ng/g之间，这与其在全球范围内的广泛消费一致。此外，卡马西平（CBZ）在1个样本中检出浓度为28 ng/g，三氯生（TCS）在一个熟西班牙贻贝样本中检出浓度为64 ng/g，全氟辛酸（PFOA）在一个熟西班牙贻贝样本中检出浓度为39 ng/g。
单变量与多变量数据分析
通过箱线图比较不同地区和烹饪方式的污染水平。结果显示，三个地区之间（西班牙、撒丁岛、利古里亚）的ECs和紫外吸收剂平均污染水平没有明显的实质性差异，但撒丁岛样本的浓度范围最窄，而利古里亚样本的变异性最大。
在比较生熟样品时，熟样中污染物的平均总浓度（图3B中用“X”表示） consistently 高于生样。此外，对于所有分析物，生样中的第三四分位数显著大于第二四分位数（为零），表明数据呈正偏态分布。熟样中出现异常值的频率也高于生样，表明烹饪后污染物的分布更加不均匀。一种合理的解释可能与贻贝的代谢循环有关，特别是葡萄糖醛酸化过程。烹饪过程中的高温和pH值变化可能导致葡萄糖醛酸结合物裂解，将其转化为活性形式，从而增加其可测量的浓度。
主成分分析（PCA）用于探索污染物、地理来源和烹饪处理之间的多维关系。前两个主成分（PCs）解释了总方差的43.9%。得分图显示样本存在一定的聚类，但PCA未揭示污染物浓度与烹饪方法或样品地理来源之间存在任何显著且清晰的相关性。
与以往研究的比较
本研究旨在评估贻贝组织中存在的污染物，以评估与其消费相关的潜在健康风险。此前一项类似研究在商业购买的贻贝中未检出任何目标化合物，作者将此归因于某些地区（如瓦伦西亚）对贻贝采用的商业净化工艺。另一项研究调查了爱尔兰的野生贻贝，其报告的卡马西平（CBZ）浓度显著高于本研究。与其他研究比较紫外吸收剂浓度时，结果存在差异。例如，本研究中奥克立林（OC）和桂皮酸盐（EHMC）的浓度低于定量限，而另一项研究在野生贻贝中报告了更高的浓度。相反，本研究检测到的辛基二甲基对氨基苯甲酸（OD-PABA）浓度（110 ng/g）高于另一项研究报告的最高值（12 ng/g）。苯酮-3（BP-3）的浓度在不同研究间具有可比性。总体而言，养殖贻贝中ECs的浓度往往高于从开放海域环境中采集的贻贝，这可能归因于其更长期地暴露于人为活动，加之养殖环境水体交换有限、缺乏强水流，可能促进了污染物的累积。
结论
本研究提出了一种快速、经济、可靠的分析方法，用于提取和定量地中海贻贝样品中的新型污染物（ECs）。成功运用QuEChERS提取结合HPLC–MS/MS分析，确定了来自不同地理区域的生、熟贻贝中ECs的存在与分布情况。
在36个样本中，有26个样本检出了ECs，其中15个样本的污染水平可定量。最普遍的污染物是咖啡因（CAFF），鉴于其广泛消费，这一结果在意料之中。此外，紫外吸收剂（特别是OD-PABA, EHS, OC, EHMC 和 BP-3）是最常检出的污染物之一。这些发现与采样时间（夏末，防晒产品使用高峰期）相吻合。
熟样 consistently 表现出更高的污染水平（无论是仅考虑紫外吸收剂的总和浓度，还是所有ECs的总和浓度），并且与生样相比，其数据分布范围更广。通过箱线图和PCA探索了样本地理来源与污染物浓度之间可能的相关性，但未发现显著的可注意关系。作为未来展望，可以分析更广泛的样本集以强化当前结果，这些结果暗示个体贻贝批次间的差异可能大于地理来源间的差异。进一步的研究还可调查葡萄糖醛酸结合物的存在，以验证烹饪促进其裂解从而导致游离污染物水平升高的假说。
尽管所获数据可被视为初步结果，但本研究首次调查了烹饪对贻贝中ECs浓度的影响，反映了这些生物被消费的实际条件。值得注意的是，这也是首次在贻贝基质中调查特定ECs（如OMT, SCL, MTPL 和 CLBT）的报告。
通过解决这些新颖方面，当前工作扩展了目前对ECs在可食用双壳类动物中行为和存在情况的理解，为未来研究奠定了基础。总体而言，本工作强调了一种标准化分析方案在ECs环境监测中的实用性；所提出的方法为评估海洋生物中的微量污染提供了一个稳健而高效的工具。未来研究将集中于扩大数据集，并在不同消费情景下纳入估算每日摄入量计算，以评估其对人体健康的潜在风险。
