《Journal of Integrative Plant Biology》：Synergistic engineering of Casδ nuclease for robust genome editing
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本项研究通过分层工程策略，成功优化了一种新型CRISPR-Cas系统——Casδ-1的基因组编辑活性。研究者聚焦于增强Casδ-1与crRNA、PAM（Protospacer Adjacent Motif）双链、单链DNA底物及RNA-DNA异源双链的相互作用，获得包含9个氨基酸替换的高活性变体enCasδ。在人类细胞中，enCasδ的编辑活性较野生型提升1.3至29.3倍，平均效率达54.6%，性能与SpCas9（Streptococcus pyogenesCas9）和Cas12核酸酶相当。在玉米中，其编辑效率平均提升5.3倍，在TS4和PSY1位点的稳定转基因株系中平均可达80%。该研究显著拓展了Casδ系统的应用潜力，为动植物基因编辑提供了高效新工具。
Synergistic engineering of Casδ nuclease for robust genome editing
摘要
CRISPR-Cas系统是广泛存在于原核生物中的适应性免疫系统，为开发多种真核生物基因编辑工具提供了宝贵资源。在经典II型Cas9系统之外，越来越多未被探索的Cas系统被发现，极大地扩展了基因编辑工具箱。其中，Casδ是最近鉴定出的一种进化过渡型CRISPR系统，以其紧凑的尺寸（约900个氨基酸）、宽广的温度耐受性以及仅需短crRNA引导（无需tracrRNA）为特征。然而，Casδ在真核细胞中的编辑效率较低，限制了其应用。
本研究开发了一种分层工程策略来提升Casδ-1（一种在动植物中均具有编辑活性的Casδ核酸酶）的基因组编辑活性。该策略聚焦于优化Casδ-1与crRNA、PAM（原间隔序列邻近基序）双链、单链DNA（ssDNA）底物以及RNA-DNA异源双链之间的相互作用。通过此策略，研究者成功构建了一种活性增强的Casδ-1变体，命名为enCasδ，其包含9个可协同增强编辑功能的氨基酸替换。
在人类细胞系中，enCasδ在十个测试的基因组位点上展现出比野生型Casδ-1高1.3至29.3倍的编辑活性，平均编辑效率达54.6%。此外，enCasδ在玉米中也介导了稳健的基因组编辑；与Casδ-1相比，其编辑效率平均提高5.3倍，在稳定转基因株系的TS4和PSY1位点平均效率可达80%。enCasδ的整体编辑性能与化脓性链球菌Cas9（SpCas9）和其他Cas12核酸酶相当。总之，enCasδ代表了一种高度优化的Casδ-1变体，拓宽了Casδ CRISPR系统的适用性，并促进了在动物细胞和植物中进行稳健的基因组编辑。
引言
CRISPR-Cas系统为开发多种多功能基因编辑工具提供了宝贵资源。除了成熟的II型Cas9系统，越来越多未被探索的Cas系统被不断发现，这有效扩展了基因编辑工具包。然而，大多数新发现的CRISPR-Cas系统在动植物中的天然基因编辑活性较差。通过合理的蛋白质工程优化其活性，已成为解决这一局限性的重要且有效的策略。
II类系统通常以单个效应蛋白为特征，特别适合基因工程应用，包括II型Cas9和V型Cas12系统。最近，一个新的V型CRISPR-Cas效应蛋白超家族被鉴定，命名为Casδ。Casδ的尺寸（867-936个氨基酸）比Cas9和Cas12a更小，具有5’-RYR-3’ PAM偏好性，且仅需一条成熟的crRNA进行DNA靶向，并显示出广泛的温度适应性。这些特性赋予了Casδ作为动植物中有价值的基因编辑工具的良好应用潜力。然而，天然Casδ的基因编辑活性相对较低，这限制了其广泛应用。
结果
在人类细胞中鉴定具有单个氨基酸替换的改进型Casδ-1变体
研究者采用分层工程策略来改进Casδ-1的编辑活性（图1A）。首先，试图鉴定具有单个氨基酸替换的Casδ-1变体，以增强Casδ-1与PAM双链（EIP）、crRNA（EIR）、RNA-DNA异源双链（EIH）以及ssDNA底物（EIS）的相互作用，从而促进靶DNA识别和水解。然后，对与EIP、EIR、EIH和EIS相关的氨基酸替换进行组合分析，以进一步提高Casδ-1的编辑活性。最后，聚合EIP、EIR、EIH和EIS的效应，以获得具有改进编辑活性的最优Casδ-1变体。
根据AlphaFold3预测的Casδ-1蛋白结构，研究者大致识别了总共200个潜在的与非精氨酸氨基酸残基，这些残基与PAM双链、crRNA、RNA-DNA异源双链和ssDNA底物相互作用或位于其周围。因此，进一步将这些非精氨酸氨基酸残基突变为精氨酸以构建Casδ-1变体。此外，有7个与PAM双链相互作用的潜在氨基酸也被替换为具有更大平面芳香环的残基，包括苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）和/或酪氨酸（Y），这已被证明可以增强与PAM双链的堆积相互作用。
为了筛选具有增强编辑活性的Casδ-1单替换变体，将每个变体克隆到蛋白质表达载体中。将该构建体与crRNA表达载体共转染到人胚肾293T（HEK293T）细胞中。编辑效率通过聚合酶链式反应（PCR）和下一代测序（NGS）结合测定。基于B2M和CⅡTA靶点，大多数变体与野生型相比活性降低。即便如此，仍有24个变体显示编辑活性增加超过20%，包括分别与EIP、EIR、EIH和EIS相关的3、3、6和12个变体（图1B，C）。
通过组合单个氨基酸替换生成用于优化EIP、EIR、EIH和EIS的候选变体
接下来，研究者尝试确定是否可以通过组合上述单个氨基酸替换来进一步优化EIP、EIR、EIH和EIS的效率，从而增强Casδ-1的编辑活性。使用人类B2M、CⅡTA和TRAC基因的三个靶点，在HEK293T细胞中进行基因组编辑活性评估。
对于EIP效率优化，从初始筛选中选择了两个变体，包括D120F和K129R，两者都位于Casδ-1的PAM相互作用（PI）结构域。随后，将D120F和K129R的氨基酸改变组合到一个Casδ-1变体中，并在HEK293T细胞中观察到编辑活性进一步增强。平均而言，D120F/K129R变体在B2M、CⅡTA和TRAC基因位点的基因编辑效率比野生型Casδ-1提高了1.60倍。因此，它被选为EIP优化的候选。
对于EIR效率优化，同样从初始筛选中选择了两个变体（K413R和K420R），两者都位于Casδ-1的楔形（WED）结构域，用于下一步组合。然而，当K413R和K420R组合时，没有观察到叠加效应，因为编辑效率低于单个K420R替换。因此，使用K420R变体作为EIR优化的候选。
对于EIH效率优化，选择了初始筛选中排名前四的变体。这些包括位于识别叶（REC-Ⅲ）结构域的K651R、K661R和E664R，以及位于桥螺旋（BH）结构域的L672R。由于L672R变体在初始筛选中表现出最佳的编辑活性，研究者认为将其与其他变体组合至关重要。总共构建了七个包含至少两个氨基酸替换的组合，其中K651R/L672R变体在B2M、CⅡTA和TRAC靶点上显示出最高的平均编辑效率。此外，虽然不同靶点间的编辑效率存在差异，但K661R变体在三个靶点的平均编辑效率与K651R/L672R变体相似。因此，K661R和K651R/L672R变体均被选为EIH优化的候选。
根据初始筛选，总共有12个与EIS优化相关的替换，其编辑活性相对于野生型Casδ-1提高了1.2倍以上，远多于为EIR、EIP和EIH效率优化鉴定的替换。为了最大限度地利用这些替换，选择了位于RuvC-Ⅱ和核酸酶叶（NUC）结构域的九个变体，并将其随机分为两组进行组合分析。第一组包括A710R、F701R、S702R、G716R和V830R变体，而第二组包括Q717R、P760R、D814R和V817R变体。
对于第一组，A710R变体在初始筛选中显示出最显著的编辑效率提升。因此，认为将其与其他变体组合至关重要。总共构建了18个组合。根据在B2M、CⅡTA和TRAC基因位点的平均编辑效率，确定了九个活性得到进一步改善的组合。其中，排名前四的组合被选为候选，包括A710R/S702R、A710R/G716R、A710R/S702R/V830R和A710R/G716R/V830R。
类似地，为第二组构建了7个组合，所有这些组合都包含Q717R替换，该替换在初始筛选中表现最佳。其中，Q717R/D814R、Q717R/P760R/D814R和Q717R/P760R/D814R/V817R的组合具有较高的编辑效率。这些组合，连同P760R单个替换，被选为第二组的候选。
通过组合EIP、EIR、EIH和EIS优化获得活性增强的Casδ-1变体
随后，研究者尝试通过整合EIP、EIR、EIH和EIS优化来进一步改造Casδ-1。首先，基于EIP、EIR和EIH优化的4个候选以及EIS优化第一组的4个候选，构建了51个组合。对于一些组合观察到了强大而显著的协同效应。其中，名为Casδ-8M的D120F/K129R/K420R/S702R/A710R/V830R/K651R/L672R组合优于其他组合，在B2M、CⅡTA和TRAC基因位点，其基因编辑效率平均比野生型Casδ-1提高了2.9倍。
接下来，研究者分别将EIS优化第二组的相应突变添加到Casδ-8M中。发现在Casδ-8M中添加P760R进一步增强了在TRAC基因的编辑性能。这个具有显著增强编辑活性的Casδ-1变体总共包含九个氨基酸替换，被命名为enCasδ。
选择Casδ-8M和enCasδ两者，基于B2M、CⅡTA、TRAC、PDCD、VEGFA和EMX1基因中的10个靶点，进一步评估编辑活性并与SpCas9和LbCas12a进行比较。所有靶点均设计为不同核酸酶间具有重叠的间隔序列。结果表明，enCasδ在10个靶点的平均基因编辑效率为54.6%，显著高于野生型Casδ-1，平均增强了8.5倍（范围从1.3到29.3倍）。Casδ-8M也观察到了编辑活性的显著增加，其平均基因编辑效率为55.1%，与enCasδ相似。此外，发现Casδ-8M和enCasδ的编辑效率总体上与两个广泛使用的Cas核酸酶SpCas9和LbCas12a在测试位点的效率相当。总之，这些结果表明，工程化的Casδ-8M和enCasδ都是在哺乳动物细胞中进行基因组编辑的高效Cas核酸酶。
enCasδ在玉米中显示出高基因组编辑效率
Casδ-8M和enCasδ在HEK293T细胞中的高基因组编辑活性促使研究者在玉米体内评估其基因编辑性能。用表达优化Casδ-1变体和靶向crRNA的构建体转染玉米原生质体，并在培养48小时后测定indel率。总共设计了PSY1、GAR2、TS1、TS3和BX9基因中的五个靶点进行评估。enCasδ在所有五个靶点的编辑效率均高于Casδ-8M，与Casδ-8M相比，增强倍数从1.1到6.5倍不等。总之，根据在人类细胞和玉米原生质体中的评估，enCasδ被选为性能最佳的组合变体。
接下来，研究者尝试使用TS1、TS3、TS4、GAPDH、GAR2、PSY1、DGK1和BX9基因上的10个靶点进一步确定enCasδ在玉米中的编辑活性。根据玉米原生质体的结果，enCasδ显示出比野生型Casδ高1.4至8.8倍的效率，平均增强5.3倍。enCasδ在TS1、TS4、GAPDH、PSY1、DGK1和BX9靶点的编辑效率范围为12.8%至22.7%，尽管在其余四个靶点仍然相对较低。同时，研究者将enCasδ的体内编辑效率与Cas9和Cas-SF01（后者是最近报道的一种工程化Cas12i3核酸酶）进行了比较。所有10个靶点在不同核酸酶间均具有重叠的间隔序列。总体而言，enCasδ在10个测试靶点的平均编辑效率与Cas-SF01和Cas9相当。特别是，enCasδ在BX9-sg2、TS4和PSY1靶点显示出显著高于Cas9的编辑效率，并在BX9-sg2、GAPDH、DGK1和PSY1靶点显示出显著高于Cas-SF01的编辑效率。研究者进一步表征了编辑TS4位点时enCasδ产生的缺失大小。基于下一代测序数据的分析表明，大多数缺失大于10bp。
然后，研究者基于玉米中随机选择的三个靶点，包括TS1、BX9-sg2和GAPDH，表征了enCasδ系统的编辑保真度。与阴性对照相比，在所有分析的11个潜在脱靶位点均未检测到可识别的indel突变。类似地，在三个代表性人类细胞靶点（包括B2M-sg1、PDCD1-sg2和TRAC-sg1）的所有14个潜在脱靶位点，也未检测到enCasδ系统的脱靶事件。这些结果表明enCasδ在基因组编辑中具有高度特异性。研究者还通过使用在间隔序列5'端包含八个随机核苷酸的PAM文库对Casδ-1和enCasδ进行了体外消耗实验，发现两者之间的PAM偏好性没有显著差异。与Casδ-1类似，enCasδ也特异性识别5’-RYR-3’ PAMs。
在评估了enCasδ在玉米原生质体中的表现后，研究者进一步选择了两个靶点，TS4和PSY1，在玉米稳定转基因株系中评估enCasδ的编辑性能。将enCasδ系统构建到一个一体化载体pBUE411中，其中enCasδ核酸酶和靶向内源TS4或PSY1基因的crRNA分别由玉米ZmUbi和ZmU6-2启动子驱动。总共获得了TS4和PSY1靶点的25个和16个T0代稳定转基因玉米株系。通过PCR扩增产物的Sanger测序分析这些转基因株系的基因型。在TS4的25个稳定株系中，有21个（84%）被鉴定出具有靶向缺失，包括6个株系，其中所有突变克隆的基因型相同，约占测序克隆的一半。进一步的靶向深度测序表明，这6个株系是杂合突变体，因为主要类型的突变体约占生成的测序读数的45.66%，与野生型读数的比例相似，而其余株系是嵌合体。类似地，通过Sanger测序和NGS，在PSY1的编辑株系中鉴定出12个（75%）具有靶向缺失，包括2个杂合突变体。与原生动质体的观察结果一致，在这些转基因玉米株系中，DNA片段缺失的大小主要在10到30bp之间。
总之，基于玉米原生质体和转基因株系的结果表明，enCasδ可以在玉米中介导稳健的体内基因编辑。
讨论
利用基因组和宏基因组序列数据库的快速增长，越来越多的CRISPR-Cas系统被发现。然而，由于所有CRISPR-Cas系统都起源于细菌、古菌或噬菌体，并且尚未进化出在植物和动物中的高效基因组编辑能力，大多数新发现的CRISPR-Cas系统作为基因编辑工具表现出较差的活性。在本研究中，研究者开发了一种分层工程策略来改进CRISPR-Cas系统的基因组编辑活性。通过鉴定高效的单个氨基酸替换，分别优化与crRNA、PAM双链、ssDNA底物和RNA-DNA异源双链相互作用的区域，以及组合优化不同区域，成功将天然Casδ-1改造为一种稳健的基因组编辑工具，命名为enCasδ。与野生型Casδ-1相比，enCasδ总共包含9个氨基酸替换，协同增强了其编辑活性。研究结果表明，此处使用的分层工程策略对于聚合尽可能多的氨基酸替换效应非常有效，从而实现了编辑活性的最大化优化，特别是在没有鉴定出具有大效应氨基酸替换的情况下。值得注意的是，此处使用的优化策略是结构引导的蛋白质定向进化的一部分，本质上涉及在蛋白质序列空间内搜索蛋白质适应度的最优解。因此，不同单突变位点的组合效应不是简单的线性叠加。换句话说，最优变体并非通过简单堆叠尽可能多的单有益突变来实现。
Casδ-1是最近鉴定的一种进化过渡型CRISPR系统，以其紧凑的尺寸（约900个氨基酸）和仅需短crRNA引导（无需tracrRNA）为特征。此外，Casδ-1显示出宽广的温度耐受性，有利于满足不同物种应用的各种温度要求。在此，研究者生成了enCasδ，一种高度优化的Casδ-1变体，在人类细胞和玉米原生质体的测试靶点上，其基因组编辑效率平均提高了8.5倍和5.3倍。enCasδ的整体编辑性能与SpCas9、LbCas12a和最近工程化的Cas12i3核酸酶（Cas-SF01）相当。研究者注意到，根据在HEK293T细胞和玉米原生质体中的测试靶点，与SpCas9相比，enCasδ仍然存在一定程度的靶点依赖性，尽管与Casδ-1相比有所降低。当然，通过其他方法，包括crRNA优化、物种特异性密码子优化和外切酶融合，进一步提高enCasδ的编辑效率和减少靶点依赖性仍有明确的空间，这些方法已被证明对优化CRISPR-Cas基因组编辑系统有效。与Casδ-1的观察结果一致，enCasδ被发现特异性识别5’-RYR-3’ PAMs，这与SpCas9的5’-NGG-3’ PAM和典型V型Cas12家族核酸酶中观察到的T-rich PAM基序明显不同，从而增加了工具包多样性以扩大靶向范围。此外，与Casδ-1相同，enCasδ诱导的主要缺失的大小也大于10bp，这有利于完全基因敲除和去除调控元件，特别是启动子区域中的增强子和转录因子结合位点。总之，研究者获得了一种活性增强的Casδ-1变体enCasδ，它将作为一种强大的工具，用于动物细胞和植物的基因组编辑应用。
