《MicrobiologyOpen》：Bridging the Cultivation Gap in Plant Microbiomes: A Comparative Study of Aerial Root Mucilage Microbiome Characterization by Conventional Isolation, Prospector High-Throughput Cultivation, and Molecular Profiling
引言
微生物高通量分子技术的出现，通过宏基因组学、宏转录组学等“组学”方法改变了我们对微生物群落的认识。然而，这些不依赖培养的方法所产生的假说最终需要培养的分离株来进行实验验证。植物相关微生物组的研究揭示了它们在宿主健康、胁迫耐受和生态系统功能中的关键作用。然而，我们对这些复杂群落的理解仍然受到一个基本方法学挑战的限制：大多数环境微生物在实验室条件下不可培养，这种现象被称为“平板计数异常”。这种培养瓶颈对微生物组研究产生了深远影响，因为它限制了获取用于生物技术应用的微生物资源，并阻碍了对预测代谢功能的验证。
传统的培养方法通常只能恢复通过分子方法观察到的微生物多样性的不到1%。这种严重的代表性不足源于多种因素，如对自然生长条件的模拟不足、快速生长生物的竞争排斥，以及我们对复杂营养和信号需求的有限理解。由此产生的对易于培养类群（如假单胞菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属）的偏见，扭曲了我们对自然环境中微生物群落结构和功能的认知。最近的技术进步已通过创新的培养策略开始解决这些限制。高通量培养平台，如由IsolationBio Inc.开发的Prospector技术，采用微型化的阵列形式，在同时测试多种生长条件时保持空间隔离。这些系统通过防止竞争排斥和提供更接近自然条件的多样化微环境，显示出在获取先前不可培养微生物方面的潜力。与此同时，下一代测序（NGS）技术极大地扩展了我们全面分析微生物群落的能力。使用第三代测序平台（如牛津纳米孔）进行的全长16S rRNA测序可提供物种水平的分辨率，同时避免了与短读长技术相关的扩增偏见。然而，分子方法无法区分活细胞与非活细胞，也无法区分代谢活跃的细胞与隐生或休眠阶段，不能直接评估功能，也不能提供分离株以供进一步研究。此外，可以推断出由于原核物种间核糖体操纵子含量不同而导致的相对丰度偏差。尽管培养方法和分子方法在微生物组研究中被广泛采用，但对其相对性能的系统比较仍然出奇地少。大多数研究要么单独使用培养法，要么单独使用测序法，错失了利用互补优势的机会。现有的少数比较研究主要集中于人类或土壤微生物组，尽管植物相关群落具有农业和生态重要性，但对其研究不足。
植物黏液由于其明确的空间边界和独特的选择性压力，成为方法学比较的理想模型系统。这种由气生根和其他植物组织分泌的富含多糖的基质，栖息着适应于波动水分和独特碳源的专门微生物群落。与土壤相比相对较低的多样性，加上强烈的宿主特异性选择，使得黏液群落在保持生态相关性的同时，适合进行全面分析。我们选择高粱和玉米的野生祖先大刍草作为互补的模型系统，以区分宿主特异性与方法特异性效应。大刍草作为玉米的野生祖先，能够研究驯化对微生物可培养性的影响，而高粱则作为一种相关的C4禾本科植物提供系统发育学比较。两种物种都产生丰富的空中根黏液，便于一致的采样和方法学比较。
本文系统地评估了三种表征植物相关微生物组的方法：（1）使用选择性培养基的传统平板培养，（2）Prospector IsolationBio高通量平台，（3）全长16S rRNA纳米孔测序。利用来自两种不同宿主植物的黏液相关细菌，我们解决了以下问题：第一，培养方法和分子多样性估计之间的定量关系是什么？方法学偏见如何影响观察到的群落结构？高通量培养技术能否显著改善对微生物多样性的获取？最终，如何优化方法选择和整合以实现全面的微生物组表征？
材料与方法
样本采集与微生物浓度测定
大刍草黏液样本采集自美国德克萨斯州大学城。高粱黏液样本取自德克萨斯A&M高粱育种项目的测试杂交种。两种样本均于2024年7月采集。每个植物物种收集三个生物学重复。黏液收集遵循所描述的方法。将黏液与无菌磷酸盐缓冲盐水混合以防止干燥并保持微生物活力。将混合物在超声波浴中处理10分钟以使微生物从黏液基质上脱离。制备一系列十倍梯度稀释液以测定样本中的微生物浓度。使用最可能数（MPN）技术，以刃天青作为代谢指示剂染料，测定生长。
代谢编码测序
为了将本研究培养的细菌与总体多样性进行比较，我们进行了16S rRNA基因序列代谢编码分析。从黏液样本中提取总DNA。使用引物27F和1492R扩增长度为~1500 bp的全长16S rRNA基因。在25 μL反应体系中进行PCR。对PCR产物进行纯化、定量并按等摩尔浓度混合。使用Oxford Nanopore Technologies（ONT）快速测序试剂盒合成混合文库。在MinION设备上使用R10.4.1流通池进行测序，运行48小时以确保足够的覆盖度和读长。
生物信息学分析
对牛津纳米孔测序获得的全长16S rRNA序列进行生物信息学分析。使用NanoFilt过滤原始读长。使用Porechop进行接头去除和去复用。使用BLAST对照EzBioCloud MTP管道v2.0 16S数据库进行物种分类鉴定。多样性分析包括alpha和beta多样性指标。所有统计分析均经过Benjamini-Hochberg FDR校正。使用PERMANOVA评估群落组成差异。
传统平板分离
从稀释液等分试样涂布在含有R2A琼脂和LGI培养基的培养皿上，分别用于分离贫营养和固氮细菌。平板在好氧条件下于30°C培养。培养后，计数分离的菌落，并计算每毫升黏液的菌落形成单位（CFU）。从每个形态学上不同的分离株中选取一个代表性菌落转移至含有R2A肉汤的96孔板中用于后续分析。使用三个技术重复进行传统分离。
Prospector分离
采用Prospector技术进行高通量微生物分离。将黏液悬液与R2A培养基混合，按照泊松分布以每孔0.5-1个细胞的浓度装载Prospector微阵列。将微阵列在加湿室中于30°C孵育24小时以防止干燥。每个生物学重复都独立通过Prospector处理。通过比较t0和t1（24小时）的荧光来监测生长。计算荧光比率以识别显示微生物生长的孔，将生长阈值设定为绿色/红色荧光比率≥1.5，表明存在代谢活性。然后将阳性孔中的细胞转移到含有R2A肉汤的96孔板中以用于后续分析和储存。
DNA提取与鉴定
通过热裂解法获得细菌菌落的粗DNA提取物。在PCR管中将单个菌落悬浮于无菌分子生物学级水中。将细胞悬液在热循环仪中于95°C加热10分钟以裂解细胞，然后在12,000×g下离心2分钟。含有粗DNA提取物的上清液用作PCR扩增模板。使用通用细菌引物27F和1492R扩增16S rRNA基因。在25 μL反应体系中进行PCR。通过Sanger测序对正向读长进行测序。
检测方法的比较分析
为了全面评估细菌检测方法的性能和互补性，我们实施了一个多方面的分析框架，比较传统培养、Prospector IsolationBio技术和全长16S rRNA测序。
结果
检测能力与方法性能比较
比较分析揭示了两种宿主植物中不同培养方法之间不同的性能特征。传统培养方法从高粱样本中获得43个分离株，从大刍草样本中获得28个分离株，显示了基线回收能力。高通量Prospector IsolationBio实现了显著更高的分离效率，从高粱样本中回收了342个分离株，从大刍草样本中回收了379个分离株，分别比传统方法提高了8倍和13.5倍。
检测能力分析表明，Prospector培养在两种宿主植物中均表现出优越的性能。它从高粱样本中检测到8个细菌属，而传统培养方法仅回收了5个属。这种性能差异在大刍草样本中更为明显，Prospector获得了12个属，而传统方法仅检测到9个属。全长16S rRNA测序（代谢编码）作为参考标准，在高粱中检测到71个属，在大刍草中检测到35个属，代表了黏液样本中存在的总可培养和不可培养细菌多样性。
Prospector在两种宿主物种中均显示出培养效率的持续改善。在高粱中，Prospector在属水平检测能力上实现了1.5倍的增强，而大刍草样本显示出更大的改进，比传统培养方法提高了1.8倍。这些结果表明，高通量培养方法可以显著扩大植物相关细菌群落中可回收部分的范围。
培养差距分析与覆盖效率
覆盖效率分析揭示了培养方法和分子检测方法之间的巨大差异。在高粱中，Prospector仅捕获了代谢编码检测到的总细菌多样性的16.9%（71个属中的12个），留下了83.1%的培养差距。对于大刍草，Prospector实现了相对较高的覆盖度，达到25.7%（35个属中的9个），产生了74.3%的培养差距；剩余部分代表了培养差距——通过分子方法检测到但通过当前培养方法无法回收的细菌类群，突出了进一步方法学发展的机会。在两种宿主植物中比较两种培养方法时，Prospector始终优于传统方法，覆盖效率分别为高粱中的16.9%对11.3%，以及大刍草中的25.7%对14.3%。宿主植物之间覆盖效率的差异表明，大刍草黏液相对于其总多样性而言，含有更高比例的可培养细菌。然而，这是否反映了群落组成、黏液特性或其他宿主特异性因素的内在差异，还需要进一步研究。
方法一致性与相关性分析
斯皮尔曼等级相关分析揭示了检测方法之间不同程度的一致性，并存在宿主特异性的一致模式。在高粱中，Prospector与代谢编码显示出中等程度的正相关（r=0.518），表明培养方法和分子群落谱之间存在合理的一致性。传统培养与代谢编码的相关性较弱（r=0.419），而Prospector与传统方法之间的相关性最强（r=0.799），表明这些培养方法检测到的是易于培养类群的重叠集合。对于大刍草样本，方法之间的相关性普遍较弱。Prospector与代谢编码的相关性一般（r=0.327），而传统培养与代谢编码显示出微不足道或负相关（r=-0.086）。培养方法之间的相关性保持中等（r=0.681），证实了它们在不同宿主植物中倾向于回收相似的分类群。
方法特异性检测模式与专属类群
对方法专属属的分析揭示了代谢编码对检测不可培养多样性的重大贡献。这种培养独立的方法在高粟中专门鉴定出59个属，在大刍草中专门鉴定出26个属，这些属通过培养方法无法检测到。值得注意的是，无论是Prospector还是传统培养都没有检测到任何方法专属属，这证实了基于培养的方法主要回收总微生物群落的子集，而不是获取完全不同的分类群。
Prospector与代谢编码之间的差异丰度分析揭示了类群回收的系统性偏差。在高粱中，诸如泛菌属、微杆菌属和寡养单胞菌属等类群显示出正的log2倍数变化，表明Prospector优先检测到它们，而包括根瘤菌属、假单胞菌属和欧文氏菌属在内的几个类群则更容易被代谢编码检测到。在大刍草中观察到了类似的模式，微杆菌属和寡养单胞菌属显示出Prospector偏好，而根瘤菌属和其他类群则更受代谢编码青睐。
植物物种间的群落结构差异
在高粱和大刍草黏液样本之间观察到了细菌属分布的明显模式。维恩图分析显示，两种植物物种之间有24个共有属，高粱专属的有48个属，大刍草专属的有10个属。两种植物物种之间的差异丰度分析显示，特定细菌谱系的相对丰度存在显著差异。高粱样本在包括泛菌属、黄单胞菌属、根瘤菌属和肠杆菌属在内的属中表现出较高的log2倍数变化，而大刍草样本则在寡养单胞菌属、微杆菌属、短小杆菌属和类芽孢杆菌属中表现出富集。
培养分离株群落组成
弦图分析揭示了两种培养方法和宿主物种之间细菌分离株回收的独特组成模式和方法的偏差。该图展示了细菌属在传统培养和Prospector培养方法之间的流动，弦的厚度代表每个属在每个培养方法中的相对丰度。
在高粱样本中，与常规方法相比，Prospector培养显示出更广泛的分类学回收。通过Prospector回收的最丰富的属包括泛菌属、假单胞菌属和芽孢杆菌属，而传统培养则以假单胞菌属、泛菌属和芽孢杆菌属为主。弦连接揭示了共享的和方法特异性的属，寡养单胞菌属和黄单胞菌属在不同方法之间显示出不同的回收模式。
大刍草分离株集合显示出培养方法之间更显著的差异。Prospector培养实现了更均衡的属代表性，主要贡献者包括假单胞菌属、芽孢杆菌属、泛菌属和寡养单胞菌属。相比之下，传统培养严重偏向泛菌属和根瘤菌属，其他属的代表性有限。这种差异凸显了通过高通量培养方法可实现的增强的分类学广度。
弦图清楚地说明了培养方法的偏见，传统方法倾向于选择快速生长的属，而Prospector培养捕获了更广泛的分类学多样性。在高粱样本中，包括农杆菌属、欧文氏菌属、克吕沃菌属和鞘氨醇单胞菌属在内的几个属，是专门或主要通过Prospector回收的，而大刍草则显示通过Prospector培养专门回收了短小杆菌属、玫瑰弯菌属和微杆菌属。弦连接的厚度变化证明了方法之间属回收效率的定量差异。
方法特异性检测网络与互补性
弦图分析说明了三种检测方法的互补性质及其与细菌属的差异连通性。在高粱中，弦图揭示了跨方法的不同检测模式，弦宽反映了相对丰度值。传统培养以假单胞菌属、泛菌属、芽孢杆菌属、寡养单胞菌属和黄单胞菌属为主。Prospector与泛菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、寡养单胞菌属、根瘤菌属、农杆菌属、黄单胞菌属、欧文氏菌属和鞘氨醇单胞菌属具有高度的连通性。代谢编码连接到最广泛的分类谱，泛菌属显示出最高的丰度，其次是微杆菌属、不动杆菌属、寡养单胞菌属、根瘤菌属和假单胞菌属。
在大刍草中，传统培养以泛菌属、根瘤菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属和玫瑰弯菌属为主。Prospector显示出与芽孢杆菌属、泛菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属、微杆菌属、短小杆菌属、玫瑰弯菌属、欧文氏菌属和根瘤菌属的强连接。代谢编码显示微杆菌属是最丰富的属，其次是寡养单胞菌属、类芽孢杆菌属、草螺菌属和芽孢杆菌属。
在高粱中，所有三种方法共享的属包括泛菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属和黄单胞菌属，而在大刍草中，只有泛菌属、假单胞菌属和根瘤菌属被所有方法检测到。代谢编码检测到了通过培养方法无法检测到的属，包括高粱中的草螺菌属、不动杆菌属、短波单胞菌属、申氏杆菌属等，以及大刍草中的慢生根瘤菌属、开斯特菌属、多变杆菌属等。
讨论
方法学性能与培养强化
我们的研究证明，Prospector是快速、高通量分离植物相关环境中微生物的高效实用平台。与传统培养方法相比，我们实现了8倍到13.5倍的分离效率提升，成功地从高粱中回收了379个独特的分离株，从大刍草中回收了583个分离株。这种增强转化为属水平检测能力的实际收益，Prospector在高粱和大刍草中分别比传统方法提高了1.5倍和1.8倍。我们对培养方法和分子检测方法的系统比较揭示了技术进步在弥合培养瓶颈方面的重大影响，为研究人员提供了可扩展的解决方案，以获取植物微生物组中可培养的部分。
可培养部分的比例远高于预期，培养方法捕获了植物相关环境中16.9%到25.7%的代谢编码确定的多样性。虽然代谢编码在高粱中检测到71个属，在大刍草中检测到35个属，但Prospector培养分别捕获了该多样性的16.9%和25.7%，而传统方法仅实现了11.3%和14.3%。这些覆盖效率代表了相对于通常报告的<1%培养成功率的显著进步，表明技术创新可以在标准实验室条件下显著扩大对环境细菌的获取。Prospector的卓越性能可能源于其维持单个细胞空间隔离的能力，同时提供更接近自然条件的多样化微环境，从而防止快速生长生物的竞争排斥，这是传统平板方法长期存在的基本限制。
方法一致性与验证框架
相关性分析揭示了检测方法之间不同程度的一致性，并存在重要的宿主特异性模式。在高粱中，Prospector与扩增子代谢编码数据显示出中等程度的正相关，表明培养方法和分子群落谱之间存在合理的一致性，而传统培养与扩增子数据的相关性较弱。观察到的最强相关性是Prospector与传统方法之间，证实了这些培养方法检测到的是易于培养类群的重叠集合，而Prospector只是从这些分类群中回收了更多样化的代表。
对于大刍草样本，方法之间的相关性普遍较弱，Prospector与代谢编码显示出一般的相关性，而传统培养则显示出微不足道的相关性。这些模式与之前在不同微生物生境中的比较研究一致，表明我们的发现在不同的植物-微生物系统中具有更广泛的适用性。
覆盖效率比较表明，Prospector在两种宿主物种中始终优于传统培养。对方法专属属的分析揭示了代谢编码在检测不可培养多样性方面的重大贡献，代谢编码专门鉴定出高粱中的59个属和大刍草中的26个属，这些属通过培养方法无法检测到。值得注意的是，Prospector和传统培养都没有检测到任何方法专属属，这证实了基于培养的方法主要回收总微生物群落的子集，而不是获取完全不同的分类群。
Prospector与代谢编码序列之间的差异丰度分析揭示了类群回收的系统性偏差。在高粱中，诸如泛菌属、微杆菌属和寡养单胞菌属等类群显示出正的log2倍数变化，表明Prospector优先检测到它们，而包括根瘤菌属、假单胞菌属和欧文氏菌属在内的几个类群则更容易被代谢编码检测到。在大刍草中观察到了类似的模式，微杆菌属和寡养单胞菌属更偏向Prospector，而根瘤菌属和其他类群则更容易被培养独立的扩增子代谢编码检测到。
宿主特异性群落结构与培养效率
宿主物种之间培养效率的差异提供了重要的生态学见解。群落结构分析揭示了高粱和大刍草黏液样本之间细菌属分布的不同模式，两种植物物种之间有24个共有属，高粱专属的有48个属，大刍草专属的有10个属。两种植物物种之间的差异丰度分析显示，特定细菌谱系的相对丰度存在显著差异，高粱样本在包括泛菌属、黄单胞菌属、根瘤菌属和肠杆菌属在内的属中表现出较高的log2倍数变化，而大刍草样本则在寡养单胞菌属、微杆菌属、短小杆菌属和类芽孢杆菌属中表现出富集。
大刍草黏液始终显示出更高的培养成功率，这表明大刍草相对于其总多样性而言，含有更高比例的可培养细菌。这种模式可能反映了不同的进化压力或群落组装过程，使得大刍草相关微生物组比高粱更倾向于支持更易于培养的类群。宿主物种之间的差异，加上大刍草更高的培养成功率，表明与这些密切相关的植物物种相关的细菌在生态策略上存在根本差异。或许有必要对黏液微生物组进行更广泛的系统研究。几种机制可能构成了这些宿主特异性培养效率差异的基础。首先，高粱和大刍草之间黏液渗出物成分的变化可能在实验室条件下差异性地支持细菌生长。此外，两种宿主起源于不同的地理区域，这可能影响了可被招募到黏液微生物组中的微生物库。另外，作物驯化从根本上改变了高粱的微生物组，可能从多样的寡营养群落转向了更适应农业养分环境的富营养组合。这或许可以解释与野生大刍草相比，高粱中易于培养细菌比例降低的原因。需要对大刍草、地方品种和现代栽培品种的黏液微生物群进行比较研究来直接验证这些假设。此外，大刍草更高的培养成功率进一步表明，在标准培养条件下繁衍生长的快速生长、营养响应型细菌更为普遍。
分类学组成与方法特异性偏见
弦图分析提供了对不同培养方法固有的分类学偏见的重要见解。在高粱中，传统培养显示出对选择属的极端偏见，假单胞菌属、泛菌属和芽孢杆菌属主导了分离株集合。Prospector培养实现了更均衡的属代表性，相同的优势属以更低、更公平的比例存在。这种模式在大刍草中更为明显，传统培养严重偏向泛菌属和根瘤菌属，而Prospector实现了更具分类学多样性的回收，主要贡献者包括假单胞菌属、芽孢杆菌属、泛菌属和寡养单胞菌属。
属特异性在培养方法之间流动的可视化清楚地表明，Prospector不仅总体上回收了更多的分离株，而且还获取了通过传统方法仍然无法检测到的分类群。几个属，包括高粱中的农杆菌属、欧文氏菌属、克吕沃菌属和鞘氨醇单胞菌属，以及大刍草中的短小杆菌属、玫瑰弯菌属和微杆菌属，是专门或主要通过Prospector培养回收的。这种扩展的分类学广度对于依赖于获取不同细菌功能的功能研究和生物技术应用具有本质性的意义。
集成方法学框架
我们的二部网络分析阐明了不同检测方法的互补性质，表明虽然培养方法只能获取总多样性的一个子集，但这个子集通常包括生态学或功能上重要的类群。弦图结构重申，培养独立的方法独特地获取了相当一部分具有培养抗性的群落成员，而培养方法则共享与可重叠培养的属的连接。在高粱中，该图显示了培养方法与一组核心的易于培养属之间的高度连通性。与此同时，代谢编码连接到了更广泛的分类谱，包括许多具有培养抗性的类群。大刍草的图结构显示了类似的模式，但整体复杂度较低，反映了该宿主中较低的总多样性。
这种互补性强烈支持采用利用每种方法独特优势的集成方法。扩增子代谢编码谱提供了全面的群落分析，这对于理解微生物多样性和生态关系至关重要，而培养方法则产生了必要的活体分离株，用于功能表征、机制研究和生物技术应用。Prospector与代谢编码之间的中等相关性表明，当培养数据在分子方法揭示的更广泛的群落结构背景下被恰当地情境化时，可以提供有意义的生物学见解。
方法选择指南与未来方向
基于我们的比较分析，我们为植物微生物组研究提出了循证的方法选择建议。不出所料，培养独立的分子方法在获取多样性方面仍然具有优势，为多样性评估目标提供了最全面的解决方案。当采用全长16S rRNA测序时，它们以最小的偏差提供了更广泛的分类学覆盖。当功能研究需要活体分离株是主要目标时，应优先考虑Prospector或类似的高通量平台，因为它们相对于传统方法在属检测方面有50%–80%的改进。
对于需要群落结构评估和功能验证能力的全面微生物组表征，结合培养独立的群落分析和增强型培养方法的集成框架提供了最佳的覆盖范围。这种整合既捕获了分子方法揭示的多样性广度，也捕获了通过培养方法获取的功能潜力。
更广泛的影响与未来研究
我们用于方法比较的定量框架提供了标准化指标，可应用于不同的微生物系统，为
