《The Plant Journal》：Structural mass spectrometry techniques for characterisation of plant and algal proteins
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这篇综述系统梳理了多种结构性质谱（MS）技术（如XL-MS、HDX-MS、Native MS等）及其在植物与藻类蛋白研究中的应用。文章指出，传统结构生物学方法（XRC、cryo-EM、NMR）在分析植物蛋白时常遇瓶颈（如表达困难、内在无序性高、翻译后修饰复杂），而结构MS技术凭借其样品需求低、耐受异质性、可探测动态与弱相互作用等优势，为解析植物蛋白的结构、构象、相互作用及功能机制提供了有力且互补的工具集，具有广阔的应用前景。
在结构生物学领域，理解蛋白质的三维结构、动态变化和相互作用机制是阐明其生物学功能的关键。然而，对于植物和藻类蛋白质的研究，传统方法如X射线晶体学（XRC）、冷冻电子显微镜（cryo-EM）和核磁共振（NMR）波谱学面临着独特的挑战。这些挑战包括蛋白质异源表达和纯化困难、显著的内在无序性、广泛的翻译后修饰（PTM）以及部分物种基因组注释不完整。正是这些瓶颈，使得结构性质谱（Structural MS）技术成为一种极具价值的互补性工具集，为植物分子和细胞生物学中关键蛋白质的结构表征开辟了新途径。
结构性质谱技术主要分为肽基方法和蛋白质基方法两大类，其核心优势在于能够使用微量、非高度纯化的样品，获取关于蛋白质结构、动力学及相互作用的详细信息。这些技术不仅可用于验证AlphaFold等工具预测的蛋白质结构模型，还能为整合建模提供实验性距离约束和溶剂可及性信息，尤其擅长解析传统方法难以捕捉的柔性区域和弱相互作用。
肽基结构性质谱
这类技术在蛋白酶将蛋白质消化成肽段后进行质谱分析，通过分析肽段上的修饰模式来推断结构信息。主要包括以下三种：
交联质谱（XL-MS）
XL-MS利用双功能试剂（交联剂）共价连接蛋白质内部或蛋白质间的两个氨基酸残基。由于交联剂具有固定的间隔臂长度，它就像一把“分子尺”，只有空间距离足够的残基才能被连接。通过质谱鉴定交联肽段，可以获得蛋白质内或复合物亚基间的距离约束，用于验证或精修结构模型，定位柔性区域，以及表征蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。例如，在拟南芥质膜H+-ATP酶 AHA2的研究中，XL-MS揭示了其未在晶体结构中解析的柔性C末端结构域与蛋白质其他结构域之间存在相互作用，支持了其形成自抑制二聚体的模型。
共价标记质谱
也称为化学足迹法，该方法使用化学试剂对溶剂可及的蛋白质侧链进行共价修饰。通过比较不同条件下（如配体结合前后）各个位点的修饰程度变化，可以推断出蛋白质的溶剂可及性、构象变化以及蛋白质-蛋白质相互作用界面。例如，在研究植物肽激素RALF1与其受体激酶FERONIA（FER）的相互作用时，通过使用EDC和甘氨酸乙酯（GEE）对羧基进行标记，发现FER的五个残基在RALF1结合后标记减少，从而揭示了激素结合界面的关键区域。
氢-氘交换质谱（HDX-MS）
HDX-MS通过测量蛋白质骨架酰胺氢与溶剂中氘（D）交换的速率来探测蛋白质的构象和动态。交换速率取决于溶剂可及性和氢键网络状态，因此能灵敏地反映二级结构的稳定性、构象变化以及结合界面。通常以比较模式进行，观察配体结合、复合物形成或突变引起的氘摄取变化。例如，对水稻机械敏感离子通道OSCA1.2的HDX-MS研究显示，其一个跨膜螺旋的氘摄取极低，表明其构象刚性，可能用于传递膜张力信号；而相邻的环和螺旋则表现出快速且双模式的氘摄取，暗示溶液中存在两种不同的构象状态。
蛋白质基结构性质谱
与肽基方法不同，蛋白质基方法直接分析完整的蛋白质或其复合物，无需预先酶切消化。
变性自上而下质谱
在变性条件下，该技术可以直接“称量”并区分完整的蛋白型（由特定序列和PTM组合定义的蛋白质分子形式）。通过分离和碎裂特定蛋白型的离子，可以获得序列信息和PTM的精确位点。这对于研究具有重要功能的PTM组合模式尤为强大。例如，在对莱茵衣藻组蛋白的变性自上而下质谱分析中，鉴定出24种不同的H3蛋白型，并发现主要的H3蛋白型携带H3K4me1修饰，这与抑制性染色质状态相关，为了解该藻类基因沉默的机制提供了线索。
天然质谱及其衍生技术
天然质谱在接近生理条件的温和电离下，将蛋白质的非共价复合物近乎完整地转移到气相中进行质谱分析。它可以直接测定蛋白质复合物的化学计量比、寡聚化状态、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-配体（包括脂质、离子）结合等，甚至能检测弱或瞬时的相互作用。
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离子淌度质谱（IM-MS）：在天然质谱基础上增加离子在气体中迁移时间的测量，可计算出碰撞横截面积（CCS），用于区分具有相同质荷比但形状（构象）不同的离子。例如，对衣藻隐花色素CraCRY的IM-MS分析显示，蓝光照射后其CCS减小，表明蛋白质构象变得更加紧凑，这与其光活化机制相符。
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天然自上而下质谱：在天然条件下电离完整的蛋白质复合物，然后选择性地解离并分析其亚基或碎片。这有助于剖析复合物的组成异质性、鉴定结合的配体，并理解复合物的组装途径。例如，通过表面诱导解离（SID）研究拟南芥PDX1.3/PDX1.2十二聚体复合物，发现两种亚基在复合物的两个六聚体环中是均匀分布的。
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软着陆电喷雾离子束沉积：这是一种将天然质谱与冷冻电镜结合的前沿技术。通过天然电喷雾电离将蛋白质复合物引入气相，经质量筛选后，将其“软着陆”沉积到冷冻电镜载网上进行成像。这种方法能够富集溶液中低丰度的特定复合物或蛋白型，从而获得其高分辨率结构。初步研究已成功应用于植物RuBisCO复合物，获得了高分辨率结构，并且表面区域的局部分辨率有所提升。
结论与展望
结构性质谱为植物和藻类蛋白质研究提供了一个强大而灵活的工具箱。它能够很好地弥补传统结构生物学方法的不足，特别适用于处理具有高内在无序性、复杂PTM和难以纯化等特性的植物蛋白样品。尽管目前已有一些成功的应用案例，但结构性质谱在植物和藻类研究领域的潜力远未被充分挖掘。随着仪器、试剂和软件的持续进步，预计这些技术将在未来几年中变得越来越重要，帮助解决植物生物学中关于蛋白质结构、动力学和相互作用的长期问题，为在气候变化背景下作物的改良工程提供关键的分子层面见解。
