《Plant, Cell & Environment》：Complex Regulation of RETINOBLASTOMA-RELATED's Interactions With E2Fs via Phosphorylation
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本项研究系统揭示了植物RETINOBLASTOMA-RELATED (RBR)蛋白的复杂磷酸化调控网络。通过鉴定拟南芥、苜蓿和油菜中RBR的13个保守CDK (CYCLIN-DEPENDENT KINASE)磷酸化位点，文章指出多位点磷酸化（特别是包含911S位点的磷酸化）能阻碍RBR与E2F转录因子及DREAM复合体成分的结合，但同时促使其与参与核糖体生物合成和蛋白质翻译的RNA结合蛋白互作。这阐明了RBR磷酸化不仅调控细胞周期进程，还介导了从转录抑制到转录后调控的功能转换，是植物响应DNA损伤和调控细胞增殖-静息平衡的关键分子开关。
在植物生长与发育过程中，细胞增殖与分化的精确平衡至关重要，而植物视网膜母细胞瘤相关蛋白RETINOBLASTOMA-RELATED (RBR)在其中扮演着核心调控角色。作为动物肿瘤抑制蛋白RB的同源物，RBR通过结合E2F转录因子及其二聚化伴侣DP (DIMERISATION PARTNER) 来抑制细胞周期进程，并参与形成大型多蛋白复合物DIMERISATION PARTNER, RB-LIKE, E2F AND MULTI-VULVAL CLASS B (DREAM)复合体。传统观点认为，细胞周期蛋白依赖性激酶CYCLIN-DEPENDENT KINASE (CDK)-CYCLIN D (CYCD)对RBR的磷酸化会抑制其与E2F的结合能力，但具体哪些磷酸化事件负责抑制RBR的细胞周期功能仍不明确。
验证植物RBR蛋白中的保守磷酸化位点
本研究通过质谱分析，在拟南芥幼苗中鉴定出RBR蛋白在16个预测CDK位点中的13个发生了磷酸化。在苜蓿根尖和油菜幼叶中，利用识别动物RB蛋白磷酸化位点S807/811的抗体，也成功免疫沉淀并鉴定出对应物种RBR蛋白（MtRBR和BnRBR）的多个保守磷酸化位点。这证实了植物RBR蛋白与其动物同源物类似，受到广泛的磷酸化调控。
多种磷酸化形式的拟南芥RBR仍能与E2F转录因子形成复合物
有趣的是，研究发现磷酸化本身并不必然阻止RBR与E2F的结合。对E2FA、E2FB、E2FC和DPB免疫沉淀复合物的质谱再分析显示，共有7个不同的RBR磷酸化肽段与E2Fs共存，其中E2FB与磷酸化RBR的结合最为广泛。这表明RBR在多个位点的磷酸化并未完全破坏其与E2Fs的相互作用，可能仅是对其活性进行微调。
RBR在911S位点的磷酸化与细胞增殖密切相关
一个关键的磷酸化位点是拟南芥RBR的第911位丝氨酸(911S)。利用特异性识别此位点磷酸化形式的抗体，研究发现P-RBR911S在增殖旺盛的组织和细胞中水平最高。在DNA损伤剂顺铂处理下，拟南芥根的生长受抑制，同时P-RBR911S的水平迅速下降，而RBR和E2FB的总蛋白量保持稳定。在苜蓿根尖和油菜幼叶等增殖活跃部位，也检测到对应位点的高水平磷酸化。这些结果表明，RBR在911S位点的磷酸化与细胞增殖状态正相关，其去磷酸化可能是DNA损伤应答中细胞周期阻滞的必要步骤。
包含P-911S的多位点磷酸化阻止RBR与E2Fs及DREAM成分结合
然而，与E2Fs共存的磷酸化RBR中并未发现含有P-911S的肽段。利用抗P-RB807/811S抗体特异性免疫沉淀获得的P-RBR911S蛋白，被发现同时在其他多个CDK位点被磷酸化，即处于多位点磷酸化状态。重要的是，这些P-911S相关的多位点磷酸化RBR形式未能与E2Fs、DPs或DREAM成分（如ALY3）发生共沉淀。这一现象在拟南芥、苜蓿和油菜中均得到验证。因此，包含911S位点的多位点磷酸化似乎标志着RBR失去了与这些细胞周期调控因子形成复合物的能力。
e2fab双突变体中活化的RBR激酶高度磷酸化RBR的911S位点，但无法磷酸化E2FC-RBR复合物中的RBR
在缺失E2FA和E2FB的拟南芥e2fab双突变体中，RBR在911S位点被高度磷酸化，但其叶片并未像e2fabc三突变体那样出现细胞过度增殖的增生表型。分子机制研究表明，在e2fab突变体中，尽管游离的RBR被高度磷酸化，但E2FC与DPB形成的异源二聚体仍能与RBR稳定结合，且该复合物中的RBR并未在911S位点被磷酸化。这提示，当RBR与E2F-DP形成复合物时，其911S位点可能无法被CDK激酶接近。
911S位点仅在未与E2Fs结合的游离RBR中可被CDK磷酸化
分子动力学模拟为上述假设提供了结构基础。模拟显示，在RBR-E2FB-DPB三元复合物中，911S位点被埋藏在蛋白相互作用界面，溶剂可及性低，难以被激酶催化。相反，在游离的RBR单体中，该位点则完全暴露。而其他一些已知影响E2F结合的位点（如406T和712S），即使在复合物状态下也保持一定的可及性。因此，不同的磷酸化事件可能分别调控RBR与E2F的结合以及从复合物中的解离。
RBR在911S位点的磷酸化改变其功能
基因本体论分析揭示了不同磷酸化状态的RBR其互作蛋白网络的显著差异。所有RBR形式（无论磷酸化状态）的互作蛋白富集在DREAM复合体等转录抑制相关成分中。而特异性与P-RBR911S形式结合的蛋白，则显著富集于具有RNA结合功能的蛋白，并参与核糖体生物发生、RNA加工和翻译等转录后调控过程。在苜蓿和油菜的对应磷酸化RBR形式中也观察到了类似的互作蛋白谱。这表明，包含P-911S的多位点磷酸化可能将RBR的功能从转录抑制转向转录后/翻译水平的调控。
讨论与模型
本研究深化了对植物RBR磷酸化调控的理解。结果表明，RBR的抑制功能至少受两种磷酸化机制调控。首先，与E2F-DP结合的RBR可能先在406T、712S等可及位点被磷酸化，削弱其与E2F的相互作用。而包含911S位点在内的C端多位点磷酸化，则可能完全破坏复合物并阻止其重组，这一步骤可能发生在E2F释放之后。其次，处于这种多位点磷酸化（含P-911S）状态的游离RBR，其与E2F/DREAM的结合能力被抑制，但同时获得了与核糖体组装和翻译相关蛋白互作的能力，从而可能参与细胞周期的转录后调控。研究还提出，可能有不同的CDK激酶分别负责磷酸化E2F结合态和游离态的RBR，以精确控制细胞周期进入的时机。综上，该研究描绘了一幅复杂的RBR磷酸化调控图谱，表明磷酸化不仅以简单的“开关”模式控制RBR的转录抑制活性，还通过改变其互作组来微调其在转录后层面的功能，从而在细胞增殖、胁迫应答和发育过程中实现更精细的调控。
