《Nature Microbiology》：Clostridia from preterm infants metabolize human milk oligosaccharides to suppress pathobionts and modulate intestinal function in organoids
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这篇发表于《自然·微生物学》的研究揭示，从早产儿肠道中分离出的、缺乏毒素perfringolysin O（PfoA）的产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens），能够代谢具有健康关联的母乳低聚糖（HMO）——二唾液酸乳糖-N-四糖（DSLNT）。该菌代谢HMO后产生的短链脂肪酸（SCFA）和色氨酸分解代谢物，不仅可抑制常见致病菌（如肺炎克雷伯菌）的生长，还能促进共生双歧杆菌的生长，并在体外类器官模型中展现出显著的抗炎效果。这项研究拓展了我们对HMO代谢微生物的认识，提示无pfoA的产气荚膜梭菌在塑造健康婴儿肠道发育中可能扮演有益角色。
肠道菌群与早产儿健康的新视角：梭菌的益生潜力
引言：母乳、HMO与早产儿肠道健康
早期肠道菌群的发育对短期及长期健康至关重要。早产儿（<32孕周）的肠道菌群发育异常，与坏死性小肠结肠炎（NEC）等病理状况密切相关。NEC是一种高死亡率和发病率的风险炎症性肠病。母乳的摄入是婴儿肠道菌群组成的重要驱动因素，并通过提供如母乳低聚糖（HMO）等生物活性因子，对NEC起到保护作用。HMO是人类无法消化的复杂非共轭糖，是部分肠道细菌的益生元，其中最著名的是与母乳喂养婴儿菌群和健康相关的双歧杆菌（Bifidobacteriumspp.）。
能够利用HMO的细菌，如双歧杆菌，可改善肠道屏障功能，积极影响免疫系统发育，降低全身炎症水平，并对抗免疫介导的疾病。这部分作用是通过包括短链脂肪酸（SCFA）和色氨酸分解代谢物在内的细菌代谢物与宿主细胞相互作用实现的。双歧杆菌还能通过对HMO的代谢分解产物，促进其他有益菌的生长并抑制病原菌，实现“交叉喂养”。然而，除了双歧杆菌，能够消化HMO的菌属范围仍不清楚，尤其是在早产儿群体中。
结果
梭菌与双歧杆菌均可代谢HMO
研究团队筛选了29株主要分离自早产儿粪便的细菌分离株，测试了它们利用6种不同HMO、葡萄糖和乳糖的能力。结果发现，仅有双歧杆菌和梭菌（Clostridium）能够利用HMO。除动物双歧杆菌（B. animalis）外，所有测试的双歧杆菌都能在至少一种HMO上生长。同样，除丁酸梭菌（C. butyricum）外，产气荚膜梭菌（C. perfringens）、第三梭菌（C. tertium）、巴氏梭菌（C. baratii）和副腐化梭菌（C. paraputrificum）也均能利用一种或多种HMO。
特别值得注意的是，有四株产气荚膜梭菌的糖利用谱与益生菌来源的婴儿双歧杆菌（B. infantis）LB1聚在一起，表明这些产气荚膜梭菌具有与该临床菌株相似的代谢功能。在所有HMO中，与健康相关的DSLNT能支持产气荚膜梭菌菌株AM1达到最高的生长密度。通过对现有公共队列数据的分析发现，梭菌在早产儿中普遍存在，但在NEC患儿中的检出率显著低于时间匹配的健康对照。进一步在菌株水平分析发现，缺乏毒素基因pfoA的产气荚膜梭菌（pfoA?）在健康对照婴儿中比NEC婴儿有更高的检出率和定植稳定性。因此，后续研究聚焦于pfoA?的产气荚膜梭菌菌株AM1。
转录组和蛋白质组学分析显示，菌株AM1在以DSLNT为碳源生长时，编码糖苷水解酶（GH）101 CAZyme的基因（推测为内切-α-N-乙酰半乳糖胺酶）以及与唾液酸代谢相关的酶（如nanM和nanA）显著上调。这些数据揭示了该菌代谢HMO的潜在分子机制。
梭菌产生更多样、更丰富的有益代谢物
研究比较了能够利用HMO的梭菌和双歧杆菌菌株的代谢物产生情况。结果显示，与双歧杆菌相比，产气荚膜梭菌和巴氏梭菌的无细胞上清液中含有显著更高的丁酸和丙酸（经生长校正后）。非靶向代谢组学分析进一步表明，梭菌菌株的代谢谱与双歧杆菌明显不同，并且产生了更多样化的代谢物。
特别是，产气荚膜梭菌和第三梭菌的无细胞上清液含有显著更高水平的色氨酸及其分解代谢物（如吲哚类物质），这些物质与促进肠道屏障功能和抑制炎症相关。此外，产气荚膜梭菌的上清液中还含有显著更高的多胺、多胺前体、组胺、神经调节剂3-羟基丁酸和N-乙酰天冬氨酸。而双歧杆菌和梭菌的无细胞上清液（巴氏梭菌除外）中苯乳酸和乳酸的水平显著高于空白培养基。
梭菌无细胞上清抑制致病菌并促进双歧杆菌生长
研究测试了梭菌和双歧杆菌的无细胞上清液对早产儿肠道中最丰富的四种致病菌（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和阴沟肠杆菌）生长的抑制作用。所有无细胞上清液对至少三种致病菌有抑制作用，其中大多数可抑制全部四种。来自益生菌婴儿双歧杆菌LB1的无细胞上清液抑制作用最强，而第三梭菌和产气荚膜梭菌的无细胞上清液也显示出高度相似的强抑制模式。
进一步的实验表明，这种抑制作用部分依赖于上清液的酸性pH，并且很可能由短链脂肪酸介导。然而，酸性空白培养基的抑制作用较弱，表明除了pH，还存在其他pH敏感的抗菌因子。
重要的是，研究发现来自菌株AM1的无细胞上清液（以葡萄糖为碳源生成）能够显著促进天然存在于婴儿体内的短双歧杆菌（B. breve）和长双歧杆菌（B. longum）的生长，但对于来源不明的商业益生菌菌株婴儿双歧杆菌（B. infantis）LB1，仅在培养后期有轻微促进作用。这表明pfoA?的产气荚膜梭菌的代谢产物可能有助于塑造一个更健康的共生菌群。
梭菌无细胞上清在肠道类器官模型中抑制炎症
研究利用从早产儿肠道组织衍生的类器官（PIO）单层，在厌氧共培养系统中评估了细菌代谢物对宿主肠道的影响。细胞毒性实验表明，多数梭菌和双歧杆菌的无细胞上清液在25%浓度下对肠道细胞系Caco-2无毒性，其中pfoA?的产气荚膜梭菌（AM1）上清液甚至保持了细胞完全活性。
在PIO模型中，当存在脂多糖和鞭毛蛋白等炎症刺激时，所有测试的无细胞上清液（来自pfoA?和pfoA+的产气荚膜梭菌、第三梭菌及婴儿双歧杆菌）均能显著抑制基底外侧白细胞介素-8（IL-8）的分泌。但只有pfoA?的产气荚膜梭菌AM1的无细胞上清液还能显著抑制顶端IL-8的分泌，而第三梭菌的上清液反而诱导了顶端IL-8的分泌增加。对于其他炎性细胞因子（如TNF、CCL2、CCL7、CXCL5），pfoA?和pfoA+的产气荚膜梭菌上清液均能抑制其基底外侧分泌，但只有pfoA?的上清液能显著抑制CCL7和CCL2的顶端分泌。
当单独使用（无炎症刺激）时，只有pfoA?的产气荚膜梭菌AM1和婴儿双歧杆菌LB1的无细胞上清液不会诱导任何显著的IL-8分泌。而pfoA+的产气荚膜梭菌和第三梭菌的上清液则会单独触发顶端IL-8等细胞因子的产生。这表明pfoA?的产气荚膜梭菌代谢产物自身不具促炎性。
pfoA基因决定了产气荚膜梭菌对肠道上皮的影响
研究人员进一步比较了活菌与宿主的相互作用。在厌氧共培养系统中，活pfoA?的产气荚膜梭菌AM1也能显著抑制炎症刺激诱导的多种细胞因子分泌，效果与无细胞上清液相似。蛋白质组学确认，pfoA+菌株的无细胞上清液中含有PfoA毒素，而pfoA?菌株的则不含。毒性实验显示，pfoA+菌株上清液使Caco-2细胞活力降至49%，而pfoA?菌株的上清液保持了99%的活力。
线粒体功能分析揭示，pfoA+菌株的上清液增加了非线粒体耗氧，减少了ATP产生，并增加了质子泄漏，损害了线粒体生物能量功能。相反，pfoA?菌株的上清液在增加质子泄漏的同时，显著增强了基础呼吸、最大呼吸、ATP产量和备用呼吸能力，整体上增强了线粒体功能。
在竞争实验中，pfoA+菌株比pfoA?菌株生长更快，并且单独存在时会显著降低肠道上皮屏障完整性。然而，如果先用pfoA?菌株预定植PIO，则能有效防止pfoA+菌株引起的屏障损伤。单独使用pfoA?菌株时，屏障完整性与未处理组相似。
讨论与意义
这项研究发现，早产儿肠道菌群中的多种梭菌能够代谢HMO。其中，缺乏pfoA毒素基因的产气荚膜梭菌菌株（属于低毒力谱系V）能够利用与健康相关的DSLNT。与双歧杆菌相比，这些梭菌能够产生更广泛、更丰富的潜在有益代谢物，包括短链脂肪酸、色氨酸分解代谢物和其他免疫调节代谢物。来自pfoA?产气荚膜梭菌的无细胞上清液能够抑制常见致病菌（特别是与NEC相关的克雷伯菌）的生长，同时促进天然存在的婴儿双歧杆菌的生长，并在类器官模型中显示出抗炎、增强线粒体功能的作用。重要的是，活菌实验表明，pfoA?菌株可以保护肠道上皮免受pfoA+病原菌株的损伤。
这些发现极大地扩展了我们对能够利用HMO的微生物多样性的理解。传统上认为有益的双歧杆菌并非唯一能利用这一重要母乳成分的细菌。研究表明，某些梭菌菌株，特别是缺乏关键毒力因子的菌株，可能在塑造健康婴儿肠道菌群、抑制病原体和调节宿主免疫方面扮演着先前未被认识的、潜在的有益角色。这为未来开发基于特定微生物（如pfoA?产气荚膜梭菌）的新型益生菌或微生物组疗法提供了令人兴奋的新方向。同时，研究也提示，如果婴儿肠道定植了携带pfoA毒素的产气荚膜梭菌，补充HMO可能存在风险。这强调了在考虑广泛补充HMO时，了解个体肠道菌群（特别是菌株水平特征）的重要性。
