《Signal Transduction and Targeted Therapy》：A biosafe mouse model for SARS-CoV-2 infection that more realistically simulates COVID-19 symptoms
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本研究建立了一种新型生物安全小鼠模型，通过K18-hACE2 KI小鼠背景结合组织特异性Cre-loxP系统，构建了可系统性（SA-N-hACE2）或肺特异性（Sftpc-N-hACE2）表达SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白的转基因小鼠。该模型对缺失N基因的SARS-CoV-2 ΔN/GFP-HiBiT复制子递送颗粒（RDPs）易感，可实现病毒高效复制但不产生感染性病毒颗粒。尤为重要的是，肺特异性N表达小鼠（Sftpc-N-hACE2）感染后仅发生肺部感染，其致死率和病理特征更接近人类COVID-19的临床表现，避免了传统K18-hACE2模型以中枢神经系统感染为主的致死弊端。此模型为在生物安全二级（BSL-2）环境下研究SARS-CoV-2致病机制、评估抗病毒药物及中和抗体提供了更安全、便捷且通真性更高的工具。
引言：寻求更佳COVID-19动物模型的必要性
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的COVID-19疫情对全球健康构成了持续挑战。动物模型对于研究病毒致病机制和开发治疗策略至关重要。虽然表达人血管紧张素转换酶2（hACE2）的转基因小鼠（如K18-hACE2模型）被广泛用于研究重症COVID-19，但这些致死模型报道的死亡主要源于中枢神经系统感染，而人类患者的死亡主因是呼吸系统感染。此外，使用具有高传染性的野生型（WT）SARS-CoV-2进行实验需要在生物安全三级（BSL-3）实验室进行，极大地限制了研究范围和可及性。因此，开发一种更安全、更能真实模拟人类COVID-19肺部病理特征的动物模型具有迫切需求。
模型构建：组织特异性表达SARS-CoV-2 N蛋白的基因工程小鼠
本研究在K18-hACE2基因敲入（KI）小鼠的基础上，利用CRISPR-Cas9技术，将包含CAG启动子、loxP-stop-loxP（LSL）序列、SARS-CoV-2 N基因编码区、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）和多聚腺苷酸尾（polyA）的组件，靶向插入到小鼠9号染色体的Tigre基因位点，构建了条件性表达N蛋白的小鼠（N-hACE2小鼠）。
通过将该小鼠与两种不同的Cre驱动小鼠杂交，获得了两种衍生品系：
- 1.
SA-N-hACE2小鼠：与表达广泛性、他莫昔芬（TAM）诱导型Cre重组酶（Rosa26-SA-CreERT2）的小鼠杂交获得。经TAM诱导后，SARS-CoV-2 N蛋白可在全身多组织中表达。
- 2.
Sftpc-N-hACE2小鼠：与表达肺表面活性蛋白C（Sftpc）启动子驱动的iCre重组酶（Sftpc-IRES-iCre）的小鼠杂交获得。其SARS-CoV-2 N蛋白的表达严格局限于肺部。
核心工具：基于反式互补系统的非感染性病毒复制模型
研究采用了一种先前开发的SARS-CoV-2反式互补系统。该系统产生的病毒颗粒名为SARS-CoV-2 ΔN/GFP-HiBiT复制子递送颗粒（RDPs），其基因组缺失了编码核衣壳（N）蛋白的基因，并被替换为双报告基因GFP-HiBiT。这些RDPs只有在能表达SARS-CoV-2 N蛋白的细胞（如工程化的Caco-2-N细胞）或本研究所构建的转基因小鼠体内，才能完成复制周期。由于其基因组不完整，RDPs不能产生具有完整感染性的子代病毒，从而大大提升了实验的生物安全性。
模型验证：SA-N-hACE2与Sftpc-N-hACE2小鼠对RDPs的易感性
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SA-N-hACE2小鼠的感染特征：经TAM诱导后，SA-N-hACE2小鼠经鼻感染不同剂量的SARS-CoV-2 ΔN/GFP-HiBiT RDPs。结果显示，小鼠出现轻微体重下降，并在肺和脑组织中均能检测到病毒载量。肺部病毒载量在感染后4天（4 dpi）达到峰值，随后下降。病理学分析显示，肺部出现从轻度到重度的进行性肺炎，表现为免疫细胞浸润增加和肺泡壁增厚，而脑组织未观察到明显的病理变化。
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Sftpc-N-hACE2小鼠的感染特征：Sftpc-N-hACE2小鼠感染RDPs后，病毒载量仅在肺部被检测到，脑部完全无病毒复制，这证实了病毒感染的组织特异性与N蛋白的表达模式严格一致。与SA-N-hACE2小鼠类似，其肺部病毒载量也在4 dpi达到峰值，并伴随进行性加重的肺炎病理损伤，而脑部无病理变化。
突破性发现：Sftpc-N-hACE2小鼠模拟COVID-19致死性肺部感染
为探究是否可引发致死性疾病，研究人员用更高剂量（5 × 106TCID50）的RDPs感染Sftpc-N-hACE2小鼠。结果显示：
- 1.
致死性：25%的小鼠因体重下降超过20%而达到安乐死标准或直接死亡。
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病理进程：肺部损伤在7 dpi最严重，之后开始逐渐修复，至21 dpi基本恢复正常。病毒载量在7 dpi后持续下降，21 dpi时已检测不到。
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无神经侵袭：在整个感染过程中，脑部始终未检测到病毒载量、病理损伤或病毒抗原，小胶质细胞/巨噬细胞也未出现明显激活，表明不存在神经炎症。
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病毒定位：通过组织透明化与光片成像技术证实，SARS-CoV-2 N蛋白分布在肺上皮细胞中，RDPs的感染也局限于肺部。
这些特征更真实地模拟了人类重症COVID-19的临床进程，即感染主要局限于肺部，死亡由严重的肺部病理和呼吸衰竭导致，而非传统小鼠模型中常见的神经侵袭。
免疫应答分析：揭示模拟临床的炎症与干扰素特征
对感染小鼠肺组织的转录组和免疫组化分析揭示了动态的免疫反应：
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免疫细胞浸润：感染早期（2 dpi），中性粒细胞（Ly6G+）和巨噬细胞（CD68+）迅速增加；4 dpi时，T细胞（CD3+CD4+, CD3+CD8+）和B细胞（CD19+）显著增多；7 dpi时，淋巴细胞持续增加。
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干扰素与炎症反应：RNA测序（RNA-seq）显示，感染早期（2 dpi），I型干扰素刺激基因（ISGs）如Ifit1, Oas2, Mx1等显著上调，启动抗病毒程序。随后（4-7 dpi），干扰素信号相关基因（如Ifnar1, Stat1）和炎症因子持续高表达。基因集富集分析（GSEA）表明，RIG-I样受体、JAK-STAT、NF-κB、TNF等促炎信号通路被激活，而TGF-β、Wnt等与组织修复相关的通路被抑制。这种早期干扰素反应相对受限、后期炎症持续加剧的特征，与重症COVID-19患者体内观察到的“炎症失衡”现象相似。
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脑部免疫反应轻微：SA-N-hACE2小鼠脑部有轻微的干扰素和炎症相关基因上调，而Sftpc-N-hACE2小鼠脑部则无显著变化，进一步印证了其感染局限在肺部的特性。
应用价值：用于抗病毒药物与中和抗体评估
为验证该模型的实用性，研究测试了抗病毒药物尼马特雷韦（Nirmatrelvir, NMV）和一种中和抗体（7B3）在SA-N-hACE2和Sftpc-N-hACE2小鼠中的效果，并与感染野生型SARS-CoV-2的K18-hACE2 KI小鼠进行对比。
结果显示，无论是NMV治疗还是7B3给药，均能显著降低两种新型模型小鼠肺部的病毒载量，并有效减轻肺部炎症病理损伤。其药效评估结果与在野生型病毒感染的K18-hACE2 KI模型中观察到的趋势一致，证明该模型可用于抗SARS-CoV-2药物的高通量筛选和效力评估。
安全性与优势
该模型具有多重安全优势：RDPs依赖外源N蛋白进行复制，在无N蛋白表达的小鼠或环境中无法建立感染和传播；测序验证未发生N基因回复突变；所有RDPs感染实验均在生物安全二级（ABSL-2）实验室完成，突破了野生型病毒必须在BSL-3实验室操作的限制。
讨论与展望
该研究成功构建了两种基于SARS-CoV-2 N蛋白反式互补系统的生物安全小鼠模型。其中，Sftpc-N-hACE2小鼠模型尤其具有价值，它精准模拟了人类COVID-19以肺部感染为核心、可进展为致死性肺炎的临床与病理特征，避免了传统模型因神经侵袭致死的偏差，为研究SARS-CoV-2的肺部致病机制提供了更真实的工具。未来，可通过结合更多组织特异性的Cre驱动小鼠，将N蛋白表达限制在特定细胞或器官，用以研究SARS-CoV-2感染如何导致特定组织损伤或长新冠（Long COVID）症状。同时，该模型也为在更普及的实验室条件下，安全、高效地进行抗病毒药物和疫苗评估开辟了新路径。
