从梅斯卡尔龙舌兰渣中酶解发酵生产酵母单细胞蛋白(SCP)的可持续生物工艺评估

《Foods》：Emerging Sustainable Bioprocess for the Valorization of Agave Bagasse for Single-Cell Protein Production Emiro Leal-Urbina, Elisa Dufoo-Hurtado, Marcela Gaytán-Martínez, Edgar N. Tec-Caamal and Aurea K. Ramírez-Jiménez

本研究评估了一种将梅斯卡尔龙舌兰渣（Agave Bagasse）酶解发酵转化为高附加值酵母单细胞蛋白(SCP)的食品级可持续生物工艺。该研究通过酶法水解释放还原糖，并利用酿酒酵母(S. cerevisiae)在澄清糖液中进行深层发酵。实验对比了摇瓶与反应器规模下的培养，发现反应器可控条件可显著提高酵母生物质蛋白含量（>40%）。结果表明，酶解结合深层发酵的工艺具有规模化潜力，为龙舌兰渣的资源化利用和可持续蛋白质生产提供了可行路径。

　　

1. 1.
   引言
   全球人口增长和饮食结构变化对粮食生产体系构成巨大挑战，预计未来几十年全球人口将超过100亿，对蛋白质的需求也将大幅增加。当前趋势仍主要依赖传统的动物蛋白来源，这伴随着高昂的环境成本，包括密集的土地和水资源利用以及显著的温室气体排放。因此，开发营养充足、环境可持续且可规模化的替代蛋白质来源至关重要。
   在诸多替代方案中，单细胞蛋白(SCP)作为一种可持续的蛋白质来源受到越来越多的关注。SCP来源于微生物生物质，主要为酵母和细菌，与植物基分离蛋白或昆虫蛋白等其他新兴蛋白来源相比，SCP培养通常更快、需要更少的土地，并能在受控发酵条件下生产具有高度组成可控性的蛋白质。在实践中，SCP生产可以通过微生物生长与低价值有机副产品的增值利用相结合，纳入循环生物经济框架，有助于实现粮食安全和可持续发展目标。木质纤维素残渣由于其丰富性、可再生性和高生物技术潜力而特别具有吸引力。
   在墨西哥，龙舌兰基饮料（尤其是梅斯卡尔）的生产产生了大量的龙舌兰渣作为固体副产物。这种富含结构性多糖的纤维残渣通常通过露天堆积、焚烧或不受控制的处置来管理，导致土壤退化、渗滤液形成、气味排放和温室气体释放。最近的生命周期评估研究已将龙舌兰渣管理确定为梅斯卡尔生产链中的主要环境瓶颈之一。
   从生物技术角度看，龙舌兰渣的增值利用为解决这些环境挑战同时产生高附加值产品提供了机会。酶法水解被广泛认为是将木质纤维素底物转化为可发酵糖流的温和且具有选择性的策略。与更剧烈的化学预处理相比，酶法过程减少了抑制性化合物的形成，并保留了碳水化合物用于后续微生物发酵。结合深层发酵，所得水解产物可以支持微生物生长和蛋白质生物合成，从而实现将农业工业残渣转化为具有营养相关性的生物质。
   在这一框架下，酿酒酵母(S. cerevisiae)代表了用于SCP生产的强大且食品级的微生物。这种酵母在食品和饮料发酵中有着悠久的使用历史，并被广泛认可为“一般认为安全”(GRAS)状态及其代谢特性明确。S. cerevisiae表现出对多种碳源的强大适应性，对木质纤维素水解产物中常见的残留抑制剂的耐受性，以及在深层发酵条件下产生富含蛋白质生物质的能力。深层发酵系统允许精确控制关键操作参数，例如通气、pH和温度，这对于实现可重复的生物质产量和实现工艺放大至关重要。
   尽管对利用农业工业残渣生产SCP的兴趣日益增长，但将龙舌兰渣用作基于酵母的SCP底物仍然有限，特别是在考虑简单且与食品兼容的加工路线时。在此背景下，本研究评估了通过酶法水解然后利用酿酒酵母进行深层发酵从龙舌兰渣生产SCP的简单策略。
2. 2.
   材料与方法
   2.1. 原料收集与制备
   龙舌兰渣取自墨西哥中部的一家梅斯卡尔酒厂，采集后立即运至实验室，储存于-20°C以防微生物降解。将渣解冻并在55°C下烘箱干燥至含水量低于10%（w/w）。然后将干燥的材料研磨并过筛以获得均匀的粒径。

2.2. 龙舌兰渣的酶法水解

将干燥研磨后的龙舌兰渣在蒸馏水中以10%总固形物（干重计）悬浮。浆液通过高压蒸汽灭菌（121°C，15 psi，15分钟）进行灭菌。冷却后，在添加酶之前使用1M HCl或1M NaOH将pH调节至4.8。水解过程中，监测pH并根据需要重新调节以将pH维持在4.8附近。

使用商业酶制剂Cellic^?CTec2（纤维素酶复合物）和Cellic^?HTec2（半纤维素酶/木聚糖酶活性）进行酶法水解。CTec2用于将纤维素水解成可溶性葡萄糖和纤维二糖，而添加HTec2以协助半纤维素解聚并改善木质纤维素基质内的纤维素可及性。纤维素酶制剂活性为120.34 FPU/mL。酶添加剂量为每克干渣0.174 mL CTec2和每克干渣0.0127 mL HTec2，对应的CTec2:HTec2体积比为13.7:1。基于添加的酶体积和干渣质量，有效纤维素酶负荷约为20.94 FPU/g干生物质，而半纤维素酶制剂则根据供应商技术指南按比例添加以支持协同水解。

水解在50°C、160 rpm振荡条件下进行24小时。孵育后，通过在100°C加热30秒使酶失活。然后将水解产物冷却至室温，以便于澄清和进一步处理。

2.3. 水解产物的澄清

酶法水解后，对液体部分进行澄清以去除残留固体并减少可能干扰酵母生长的可溶性化合物。澄清策略旨在保持食品兼容的加工条件，仅采用水相操作，未使用木质纤维素燃料加工中常用的有机溶剂或化学解毒试剂。

简要来说，将pH调节至5，并以2%（w/v）添加粉末活性炭。悬浮液在45°C、150 rpm振荡下孵育1小时。处理后的水解产物在4°C、11,000 rpm下离心10分钟以去除悬浮固体和活性炭颗粒。上清液随后通过实验室级滤纸，接着是Whatman 42号、2号和1号滤纸顺序过滤进行澄清。最后使用0.45 μm尼龙膜过滤以获得澄清、无颗粒的水解产物。澄清的水解产物储存在4°C，并在3天内用于发酵实验。

2.4. 微生物与接种物制备

选择一种食品级酵母用于SCP生产，基于其适用性、有氧生长性能和对木质纤维素水解产物的耐受性报告。使用酿酒酵母(S. cerevisiae)的商业菌株。储备培养物在无菌条件下在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(YPD)培养基上保存。

发酵前，通过在受控温度和通气条件下在液体YPD培养基中培养酿酒酵母直至细胞达到指数生长期来制备酵母接种物。通过使用血球计数板在光学显微镜下直接计数确定细胞浓度，并使用600 nm处的光密度(OD₆₀₀)作为补充指标来调整接种物密度。为了在时间曲线图中将OD₆₀₀与生物质浓度相关联，使用酿酒酵母的文献校准将OD₆₀₀转换为干重，其中大约30个OD单位对应于7.5 g干生物质/L，相当于每OD₆₀₀0.25 g DCW/L的转换因子。

将适当体积的活跃生长培养物直接转移至发酵培养基，以获得约1×10⁷个细胞/mL的初始浓度。接种物对应于约5-10%（v/v），具体取决于预培养物的细胞密度。

2.5. 发酵培养基与深层发酵

澄清的龙舌兰渣水解产物用作深层发酵的主要碳源。为了支持有氧生长和蛋白质形成，水解产物补充了按功能分组的食品级营养素：氮混合物、缓冲盐、镁源和痕量矿物质溶液。本研究中使用的补充策略为每升工作体积：总添加有机氮当量为0.3至1.2 g N，总磷酸盐缓冲能力为10至50 mM，镁源当量为0.1至1.0 g MgSO₄，以及添加0.1至1.0 mL食品级预混物作为痕量矿物质。水解产物和耐热盐一起高压灭菌。初始碳氮比(C:N)是基于接种时DNS还原糖（以葡萄糖当量表示）和总添加氮计算的。在所有酵母培养条件下，初始C:N范围为12至28。

根据实验条件和培养规模调整初始还原糖浓度。龙舌兰渣的酶法水解在24小时后释放约17 g/L还原糖，这作为发酵培养基的基础水解产物，并被选为基线条件，因为它反映了工艺无需外部碳补充时的预期性能。在摇瓶规模，低糖浓度(LF，8 g/L)来自澄清水解产物，中糖浓度(MF，17 g/L)和高糖浓度(HF，50 g/L)则通过向水解产物中添加葡萄糖获得。在生物反应器规模，评估了两种底物浓度（R1和R2）。反应器2仅使用澄清水解产物，无外部碳补充，而反应器1由补充葡萄糖以达到所需浓度的水解产物组成。报告值对应于使用DNS方法在接种时测得的还原糖（R1为20.68 g/L，R2为16.30 g/L）。所有发酵培养基的初始pH在灭菌前调节至5.3。培养基通过在121°C、15 psi高压灭菌15分钟进行灭菌，并在接种前冷却。

在摇瓶和实验室生物反应器规模进行深层发酵，以评估培养规模和氧气可用性对酵母生长和蛋白质生产的影响。在定义的采样点收集样品用于生物质、蛋白质和底物分析。在摇瓶规模，每1-3小时取样一次，而在生物反应器实验中，在指数生长期取样更频繁，在培养后期取样较少。

2.5.1. 摇瓶规模发酵条件

摇瓶发酵在含有50 mL培养基的250 mL锥形瓶中进行。培养物在30°C、150 rpm轨道振荡下孵育。底物可用性由DNS方法测定的初始还原糖浓度定义。发酵过程中，pH未被主动控制；瓶子用棉塞封闭以允许被动气体交换。

2.5.2. 生物反应器规模发酵条件

生物反应器发酵在总容积2 L、工作体积1 L的搅拌罐系统中进行，配备在线pH、温度和溶解氧(DO)监测。培养物在30°C以分批模式运行。通气初始设定为1 vvm，搅拌由机械搅拌提供，叶轮转速调节至200-300 rpm以确保充分混合和氧传递。DO被数字化监测并通过设定点使用级联策略控制。控制器优先将搅拌作为第一操纵变量，增加叶轮速度以满足DO设定点。当搅拌达到最大操作限制时，通气被用作第二操纵变量，并逐步增加直到DO设定点恢复并维持。这种控制方法允许在不突然改变气体流量的情况下增加氧传递，同时保持跨生物反应器运行的相同DO设定点框架。

从摇瓶放大到生物反应器主要基于增加搅拌强度以改善氧气可用性，同时保持培养基组成和其他物理化学条件与摇瓶规模实验一致。

使用两个反应器条件（R1和R2）来评估氧气可用性和底物组成对酵母生长和蛋白质生产的影响。在反应器1中，通过调节通气速率和搅拌速度，主动控制溶解氧并维持在30%空气饱和度以上。在反应器2中，在发酵的初始阶段，溶解氧没有严格维持在此水平之上，允许在后期阶段逐渐引入控制之前存在部分氧限制。在整个生物反应器实验过程中，通过自动添加酸或碱在线监测pH并将其主动控制在5.3。所有其他操作参数保持恒定。

2.6. 分析方法

2.6.1. 生物质定量

通过干重(DCW)测定酵母生物质。简要来说，将确定的培养物体积在5000×g离心10分钟，所得沉淀用蒸馏水洗涤两次以去除残留的培养基组分。然后将生物质转移至预称重的容器中，并在60°C干燥至恒重。在发酵结束时测定DCW。生物质浓度通过减去皮重并归一化至原始样品体积计算，并以每升培养物的干生物质克数表示。同时，通过测量600 nm处的光密度(OD₆₀₀)监测发酵过程中的酵母生长。

2.6.2. 蛋白质测定

使用凯氏定氮分析法测定酵母生物质的粗蛋白质含量，遵循标准化程序，结果以干生物质为基准，使用蛋白质(%)=氮(%)×氮-蛋白质转换因子表示。将约100 mg干燥生物质样品在硫酸钾-硫酸铜催化剂存在下用浓硫酸消化，将有机氮转化为铵。随后将氨蒸馏到硼酸溶液中，并用标准化的0.1 N盐酸滴定定量。

使用6.25的氮-蛋白质转换因子将总氮含量转换为粗蛋白质。蛋白质含量以基于干生物质的蛋白质百分比表示。

2.6.3. 糖分析

使用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定水解产物和发酵样品中的还原糖。使用葡萄糖作为参考标准制备校准曲线，并使用分光光度计在540 nm测量吸光度。结果以还原糖当量（g/L，以葡萄糖当量表示）报告。

由于DNS测定法量化了总还原当量，它无法区分单个单糖、短还原寡糖或木质纤维素水解产物中可能存在的其他还原化合物。因此，所有糖浓度均报告为DNS还原糖当量（g/L，葡萄糖当量），用于产率计算和动力学建模的底物变量S代表此总还原当量池。DNS值被用作总体还原糖当量池及其在发酵过程中随时间减少的操作性指标，而不是作为单个可发酵糖的具体量化。对于摇瓶规模实验，每1-3小时分析样品，而在生物反应器发酵中，在指数生长期取样更频繁，在后期培养阶段取样较少。

2.7. 动力学建模与参数估计

将生物质生长曲线（X，g/L）拟合到四种常用的经验生长模型：Logistic、Gompertz、Richards和von Bertalanffy。通过使用实验时间序列生物质数据的非线性最小二乘回归估计模型参数。使用决定系数(R²)和均方根误差(RMSE)评估拟合优度。

1. 3.
   结果与结论
   酶法水解24小时释放的还原糖在11-17 g/L范围内。利用所得澄清糖液，在深层条件下培养酿酒酵母，进行了摇瓶和2 L搅拌罐生物反应器实验。在摇瓶规模，试验了初始糖浓度为8、17和50 g/L；在2 L搅拌罐生物反应器规模，试验了初始糖浓度为20.68 g/L（R1）和16.30 g/L（R2）。在摇瓶规模，最终生物质浓度随初始糖水平增加而增加。最终生物质浓度达到6.18±0.27、8.02±0.55和9.28±0.10 g/L，而粗蛋白质含量则保持在10%以下（3.40±0.15至8.69±0.09 g/100 g干重）。相比之下，生物反应器培养导致了更高的蛋白质富集，在两种氧气条件下蛋白质含量均超过40%（41.71±0.47至45.80±0.43 g/100 g干重）。总体而言，研究结果支持酶法水解结合受控深层发酵作为一种可规模化的方法，可将龙舌兰渣增值转化为富含蛋白质的酵母生物质。