《Foods》：Development of a Layer-by-Layer Zein/CMCS Microcapsule Platform for Bacteriophage Delivery: A Proof-of-Concept Study Using a Model Phage in Sea Bass
Weiquan Liang,
Tangwu Qiu,
Zheng Cheng,
Yunqian Sun,
Yunyun Zhong,
Xueqin Zhang and
Le Zhong
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本研究开发了一种基于玉米醇溶蛋白（zein）和羧甲基壳聚糖（CMCS）的食品级层层自组装（LbL）微胶囊系统，用于递送裂解性噬菌体。该系统通过静电和氢键相互作用形成多层结构，显著增强了噬菌体对热（60°C/70°C）、极端pH（2.0/12.0）胁迫的耐受性，并在模拟鱼汁中展现出可控释放特性。应用至鲜切海鲈鱼（Lateolabrax japonicus）的保鲜试验表明，负载噬菌体的三层微胶囊（CMCS3）可有效延缓冷藏期间pH上升、抑制微生物生长（总活菌数TVC<6 log CFU/g）、控制脂质氧化（硫代巴比妥酸反应物TBARS值维持在0.62 mg MDA/kg），并较好地保持鱼肉质地与色泽稳定性，为水产品噬菌体生物保鲜提供了一种具有物理保护、缓释和应激耐受性的新策略。
1. 引言
鲜切水产品，如海鲈鱼（Lateolabrax japonicus）鱼片，因其高水分和富营养的基质，易于腐败微生物快速增殖，同时内源性酶会导致肌肉蛋白水解和脂质氧化。传统保鲜策略如冷藏、气调包装和化学防腐剂，常因有效期短、可能引起不良风味变化或化学残留问题而受限。因此，对天然、安全保鲜替代品的需求日益增长。
噬菌体（Bacteriophages）作为能够特异性裂解宿主细菌的病毒，是有前景的天然靶向生物控制剂。其核心优势在于宿主特异性高、安全性可靠，且对食品感官品质无不良影响，已被美国食品药品监督管理局等监管机构认可为“一般认为安全”。然而，噬菌体在水产品中的直接应用仍存在障碍，主要挑战在于环境不稳定性，如pH、温度波动、离子强度、内源性蛋白酶、暴露于碳水化合物等，这些因素可能导致噬菌体颗粒失活，造成有效滴度显著下降，最终限制其实际应用效果。因此，开发能够保护噬菌体并维持其长期活性的递送系统，成为推动其工业化应用的关键。
层层自组装是一种通过静电相互作用、氢键、范德华力等多种分子间相互作用，逐层构建有序多层结构以沉积生物活性分子的技术。该技术因其工艺设计可调、多功能模板、操作条件简单温和、天然吸附驱动等优势，被广泛应用于环境敏感组分的包装与递送。鉴于LbL技术的上述优点，它非常适合用于封装和保护如噬菌体这类环境敏感的生物活性物质。因此，实现有效LbL封装的关键在于选择合适的壁材。
基于结构、功能和安全性考虑，本研究选择玉米醇溶蛋白和羧甲基壳聚糖构建LbL系统。CMCS是一种阴离子多糖，能够通过静电相互作用吸附在噬菌体表面形成稳定的初级复合物，并进一步与带正电的聚电解质牢固相互作用，通过LbL组装产生稳定的双层和多层外壳。此外，CMCS具有良好的生物相容性、粘膜粘附性和固有的抗菌活性，可协同增强保鲜效果。玉米醇溶蛋白因其优异的成膜能力、生物相容性、可生物降解性、自组装特性和两亲性而被选为LbL基底。其独特的疏水性和两亲结构使其能够用于递送各种功能性化合物，包括脂溶性维生素、多酚、精油和益生菌。重要的是，玉米醇溶蛋白被归类为“一般认为安全”，确保了完全的食品级安全性，这是相对于许多合成或非GRAS替代品的决定性优势。
然而，综合利用这两种食品级材料并基于其静电互补性设计LbL序列来封装噬菌体的研究迄今未见报道。因此，本研究旨在以CMCS和玉米醇溶蛋白为壁材，利用LbL技术开发和设计一种新型噬菌体微胶囊。
2. 材料与方法
2.1. 材料
宿主菌为从腐败海鲈鱼中分离并经16S rRNA基因测序鉴定为Acinetobacter junii的FB06菌株。噬菌体为从鱼市废水中分离的、针对FB06的裂解性噬菌体（命名为Zk-X6）。羧甲基壳聚糖和玉米醇溶蛋白购自商业供应商。所有其他化学试剂均为分析纯。
2.2. 方法
2.2.1. 玉米醇溶蛋白纳米分散液的制备
参考并略微修改Liu Bu的方法。简要步骤如下：将1.0 g玉米醇溶蛋白粉末溶解于50 mL 80% (v/v)乙醇溶液中，磁力搅拌后静置以确保完全溶解。随后，在恒温水浴条件下，将上述玉米醇溶蛋白-乙醇溶液缓慢注入持续搅拌的去离子水中，诱导蛋白质反溶剂沉淀形成纳米颗粒。搅拌后，用旋转蒸发仪去除残留乙醇。最后，用HCl或NaOH溶液将分散液的pH调节至5.0，于4°C冰箱保存备用。所得玉米醇溶蛋白纳米颗粒水分散液的最终浓度为2 mg/mL。
2.2.2. CMCS溶液的制备
准确称取400 mg羧甲基壳聚糖粉末溶解于200 mL超纯水中，磁力搅拌至完全溶解。用HCl或NaOH溶液将所得CMCS溶液的pH调节至5.0，得到浓度为2 mg/mL的储备液，于4°C冰箱保存备用。
2.2.3. CMCS-噬菌体微胶囊的制备
- 1.
第一层沉积：将9 mL CMCS溶液与1 mL噬菌体悬液混合，涡旋后室温静置，使带负电的CMCS吸附到带正电的噬菌体表面。离心弃上清，用PBS重悬并洗涤沉淀，最终产物标记为CMCS1。
- 2.
第二层沉积：将CMCS1沉淀重悬于玉米醇溶蛋白纳米分散液中，轻轻搅拌使带正电的玉米醇溶蛋白吸附到CMCS1的负电表面。离心洗涤后，所得双层微胶囊标记为CMCS2。
- 3.
第三层沉积：将CMCS2沉淀重悬于新鲜的CMCS溶液中，重复吸附、离心和洗涤步骤，最终得到三层微胶囊，标记为CMCS3。
2.3. LbL组装过程中噬菌体的存活率
通过比较从破裂微胶囊中回收的噬菌体滴度与用于封装的初始噬菌体悬液滴度，计算封装效率（EE），以评估组装过程中噬菌体活性的保留情况。
2.4. Zeta电位测量
使用NanoBrook 90 Plus PALS分析仪在25°C下测量未包被噬菌体及三种微胶囊制剂（CMCS1, CMCS2, CMCS3）的Zeta电位值。
2.5. 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
采用4–20%预制胶进行非还原性SDS-PAGE。将玉米醇溶蛋白和不同层数微胶囊的等分试样与上样缓冲液混合，加热后上样。电压设置为160 V，电泳约1小时。凝胶用考马斯亮蓝G-250溶液染色，脱色后记录电泳图像。
2.6. 傅里叶变换红外光谱分析
将不同层数的微胶囊、玉米醇溶蛋白和CMCS的冻干粉末分别与溴化钾按质量比1:100混合，研磨压片。使用FT-IR光谱仪在波数范围400–4000 cm-1内分析微胶囊的化学结构及相互作用。
2.7. 热稳定性分析
将湿微胶囊或噬菌体悬液加入无菌管，分别于60°C和70°C孵育60分钟。加热完成后，加入SuperMicro缓冲液快速冷却，然后计数存活的噬菌体。
2.8. pH处理稳定性分析
将湿噬菌体微胶囊或噬菌体悬液加入无菌管，分别置于pH 2.0或pH 12.0条件下处理60分钟。通过系列稀释，使用双层琼脂覆盖噬斑法测定噬菌体滴度。
2.9. 微胶囊化噬菌体在海鲈鱼片上的稳定性
将无菌海鲈鱼片浸入FB06菌液中，干燥后，再浸入游离噬菌体或CMCS3悬液中，沥干，真空包装于无菌袋中，4°C储存。在第0天和第5天测量噬菌体滴度。
2.10. 噬菌体微胶囊的释放行为
在加速条件下研究体外释放曲线。简要步骤为：将湿微胶囊或游离噬菌体悬液置于含有模拟鱼渗出液的管中，于37°C、220 rpm的摇床中孵育。在预定时间点取样，立即使用标准双层琼脂覆盖噬斑法测定各样品中的噬菌体滴度。
2.11.-2.15. 海鲈鱼片冷藏期间各项指标测定
包括pH值、总活菌数、硫代巴比妥酸反应物、总挥发性盐基氮以及色泽（L, a, b*值和总色差ΔE）的测定，方法均依据所述标准或修改步骤进行。
2.16. 统计分析
所有数据均以三次独立重复的平均值±标准差表示。微生物计数在进行统计分析前进行log10转换。使用SPSS Statistics 24.0进行单因素方差分析，当存在显著差异时，使用Tukey’s HSD检验进行事后多重比较。显著性水平设定为α=0.05。
3. 结果
3.1. LbL组装过程对噬菌体存活的影响
三种封装层数对噬菌体滴度的影响如表1所示。包被前后噬菌体活性表征发现，各层微胶囊组的噬菌体滴度均有下降。基于对数滴度，使用线性噬菌体浓度根据公式计算相应的封装效率。CMCS1、CMCS2和CMCS3的EE值分别为8.13%、7.25%和6.31%。噬菌体滴度的下降可能归因于组装过程中离心、溶液加载转移以及高速分散器中胶囊破裂等操作导致的不可避免的噬菌体损失。
3.2. LbL组装后噬菌体微胶囊Zeta电位的变化
选择阴离子聚合物CMCS作为初始层，通过静电引力沉积到带正电的噬菌体表面。沉积后，CMCS1微胶囊的表面电位反转为-22.37 mV。如图2所示，这种正负交替的模式在随后与玉米醇溶蛋白和CMCS的逐层组装中持续存在。这种特征性的Zeta电位反转是LbL组装成功的标志，强烈表明静电相互作用是逐步吸附的主要驱动力。在此类生物聚电解质系统中，次级非共价相互作用（如氢键）可能在稳定多层结构方面发挥协同作用。
3.3. LbL组装后噬菌体微胶囊的SDS-PAGE特征
SDS-PAGE是分析蛋白质亚基表达和分子量变化的经典方法。为探究噬菌体与LbL底物之间的相互作用力，进行了电泳实验。在玉米醇溶蛋白纳米颗粒的谱图中观察到α-玉米醇溶蛋白的特征条带。组装得到的几种微胶囊均未产生新的条带，这表明噬菌体与LbL底物之间未涉及共价相互作用。
3.4. LbL组装后噬菌体微胶囊的FT-IR特征
进行FT-IR分析以研究材料间的相互作用并识别特征官能团。纯玉米醇溶蛋白的FTIR谱图在3326、2961、1664和1531 cm-1处显示出特征峰，分别归属于O-H伸缩、C-H伸缩、酰胺I的C=O伸缩和酰胺II的N-H弯曲。对于CMCS，3390 cm-1处的峰归属于O-H伸缩，2914 cm-1处的峰与疏水性C-H伸缩的强振动有关，1598 cm-1处的峰归属于N-H弯曲。形成CMCS3复合材料后，O-H伸缩振动从3326 cm-1移至3332 cm-1，表明玉米醇溶蛋白和CMCS之间形成了氢键。观察到的玉米醇溶蛋白酰胺I带从1663 cm-1移至1660 cm-1，表明玉米醇溶蛋白和CMCS之间发生了静电相互作用，这与已有文献一致。
3.5. 噬菌体微胶囊热稳定性分析
高温是限制游离噬菌体使用的主要制约因素。为提高其热稳定性，本研究采用了微胶囊化技术。在60°C加热1小时后，游离噬菌体滴度下降，而包被了CMCS1、CMCS2和CMCS3层的噬菌体滴度下降幅度显著减小。在更严酷的70°C条件下，游离噬菌体完全失活，而微胶囊化样品的滴度损失显著降低。这些结果表明，微胶囊化有效保护了噬菌体免受热失活，其中多层包被（CMCS2和CMCS3）提供的保护明显优于单层。总体而言，双层和三层微胶囊对噬菌体提供了相似的高水平热保护。这种现象表明，微胶囊对热胁迫的保护功效在达到一定的壳层复杂度后可能趋于稳定。
3.6. 噬菌体微胶囊pH稳定性分析
为评估微胶囊化对噬菌体pH耐受性的影响，将封装噬菌体置于与游离噬菌体相同的pH条件下。首先测定游离噬菌体在pH 2和pH 12的SM缓冲液中1小时后的滴度，显示在两种情况下均完全失去活性。相比之下，微胶囊化显著增强了噬菌体在极端pH下的稳定性。在三种微胶囊配方中，pH耐受性随壳层增加而改善：CMCS1 < CMCS2 < CMCS3。在pH 2处理1小时后，CMCS1、CMCS2和CMCS3的滴度下降值不同。在pH 12下，滴度下降值也不同。尽管潜在机制尚不清楚，但推测环境pH的变化可能触发羧甲基壳聚糖-玉米醇溶蛋白壳的逐渐溶解。这可以延迟噬菌体暴露于恶劣条件的时间，同时减轻与极端酸度或碱度的直接接触，从而提高噬菌体存活率。与热稳定性结果不同，在极端pH胁迫下，微胶囊的保护功效显示出清晰的层级依赖性：CMCS3 > CMCS2 > CMCS1。这一对比表明，多层壳结构抵抗热胁迫和pH胁迫的机制可能存在本质差异。
3.7. 微胶囊化噬菌体在海鲈鱼片上的稳定性
微胶囊化和游离噬菌体在4°C储存5天期间均在海鲈鱼片上保持高稳定性。然而，两者表现出显著差异：与游离噬菌体组相比，微胶囊化噬菌体组表现出更高的稳定性。具体而言，储存5天后，微胶囊化噬菌体组的滴度仅下降，而游离噬菌体组的滴度下降更显著。这种稳定性差异的主要原因可能包括：微胶囊为噬菌体提供了有效的物理保护；游离噬菌体直接暴露于鱼片表面，易因水分迁移、鱼体自身汁液渗出等因素分布不均或损失，导致其有效浓度迅速下降；海鲈鱼表面可能存在蛋白酶、脂质氧化产物和微生物代谢产物等不利因素，游离噬菌体可能更容易受到这些因素的抑制而失活。最终，这些因素共同导致游离噬菌体组的滴度下降更为显著。
3.8. 噬菌体微胶囊的释放行为
为比较不同微胶囊配方的释放调节效果，在模拟鱼渗出液介质中进行了体外释放研究。所有三种类型均在60分钟内表现出快速的初始释放，分别达到峰值滴度，随后进入平台期，表明存在持续释放模式。值得注意的是，CMCS2和CMCS3组在8小时后观察到滴度下降。对此现象提出两种相互关联的因素解释：首先，释放介质中游离噬菌体颗粒在长时间内的内在不稳定性可能导致感染性逐渐丧失；其次，也是更具体于多层结构的是，微胶囊壁材料的动态变化可能促进“再吸附”效应。在长时间释放过程中，CMCS2和CMCS3的聚电解质壁可能发生部分溶胀、侵蚀或不对称降解。此过程暴露出新鲜的带电片段，这些片段可能与最近释放的噬菌体颗粒发生静电相互作用，导致其瞬时的再吸附或聚集。
3.9. 冷藏期间海鲈鱼片的pH分析
在所有处理条件下，海鲈鱼在冷藏储存期间的pH值变化呈现先降后升的趋势。早期储存阶段所有组别的pH值持续下降，这可能归因于鱼肌肉组织中糖原的厌氧糖酵解导致乳酸形成，以及ATP降解为琥珀酸等酸性化合物。这些酸性代谢物的
