《Foods》：Multigrain Bread: Impact of Germinated Grain Supplement on Phytochemical Profile and Technological and Nutritional Properties
Andrej ?ivkovi?,
Toma? Polak and
Toma? Po?rl
编辑推荐：
本研究通过液质联用（LC–MS/MS）等技术，系统评估了添加30%和60%萌芽斯佩耳特小麦、裸燕麦及荞麦对小麦面包营养价值、抗氧化活性、膳食纤维、质构及感官特性的提升效果，证实了萌芽谷物作为功能性烘焙配料在提升面包总酚含量（TPC）、抗氧化活性（AA）及膳食纤维方面的显著作用，为开发健康促进型烘焙产品提供了依据。
引言：功能化面包的开发需求
现代饮食结构中普遍缺乏促进健康的营养素，这推动了营养强化型主食的开发。谷物及其制品消费广泛，是进行营养强化的理想载体。萌芽是一种天然过程，能够提高营养素的生物利用度，使其成为烘焙行业中优秀的功能性配料。在萌芽过程中，水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、植酸酶）被激活，导致淀粉和贮藏蛋白质部分降解，并减少植酸等抗营养因子。将萌芽全谷物种子加入小麦面包可以改善质地、风味、抗氧化剂和膳食纤维含量。本研究选取了具有不同且互补的植物化学成分谱的萌芽斯佩耳特小麦（Triticum spelta）、裸燕麦（Avena nuda）和荞麦（Fagopyrum esculentum），旨在系统评估它们对白小麦面包植物化学特征及整体质量的影响。
材料与方法
2.1. 材料
研究使用了荞麦品种‘?ebelica’、裸燕麦品种‘Kamil’和斯佩耳特小麦品种‘Ostro’，均为2023年斯洛文尼亚当地有机生产。使用前，谷物在4°C干燥黑暗条件下储存于纸袋中。
2.2. 萌芽方法
萌芽前，种子经过去除杂质和破损籽粒的处理。在20°C水中浸泡（种子与水比例为1:5 (w/v)），浸泡期间每小时换水以降低微生物污染风险。浸泡后，将种子薄层铺在穿孔金属托盘上，置于生长室中，确保高空气湿度（相对湿度>95%），并在20°C下萌芽72小时。在将种子加入面包面团前，将其分装成500g批次，并在80°C下热处理40分钟，以防止酶过度活性和确保微生物安全。
2.3. 面包样品制备
使用直面团法在受控实验室条件下制备对照面包。所有实验面包样品的详细配方参见原文Table 1。根据添加萌芽谷物的类型和添加水平对面包进行编码：对照、S30和S60（添加30%和60%萌芽斯佩耳特小麦）、O30和O60（30%和60%萌芽燕麦）、B30和B60（30%和60%萌芽荞麦），以及MG30和MG60（30%和60%多谷物配方）。成分在螺旋混合机中低速混合3分钟，高速混合12分钟。混合后，面团在搅拌碗中静置30分钟，然后分割成320g的小块，放入模具，转移至发酵室（28°C，76%相对湿度）发酵45分钟。烘烤在层炉中进行：230°C蒸汽喷射5分钟，然后190°C烘烤20分钟，最后200°C烘烤4分钟。
2.4. 膳食纤维含量
采用酶-重量法（AOAC 991.43）测定膳食纤维含量。使用三种酶（耐热性α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶）在不同条件下水解样品。膳食纤维组分是消化非膳食纤维成分后获得的不消化残渣。不溶性膳食纤维通过过滤回收，可溶性膳食纤维用96%乙醇从滤液中沉淀。测定纤维残渣中的灰分和蛋白质含量以校正数据。总膳食纤维定义为不溶性和可溶性膳食纤维含量之和。
2.5. 游离酚类化合物提取
将面团和面包样品在液氮中冷冻并用实验室研磨机研磨。用70% (v/v) 甲醇水溶液提取游离酚类。将1g研磨样品与3mL提取溶剂混合，在室温、黑暗条件下以200rpm振荡40分钟。离心后收集上清液。提取过程重复两次，合并的提取物用提取溶剂定容至10mL。经0.45μm针式过滤器过滤后，提取物在2°C保存，并在24小时内分析总酚含量（TPC）和抗氧化活性（AA）。
2.6. 结合酚类化合物提取
甲醇提取后剩余的残渣用氢氧化钠水解。固体材料用20mL 2M NaOH处理，在室温下以200rpm振荡4小时。水解后，用浓甲酸将混合物酸化至pH 3.2–3.4，离心，上清液用0.45μm针式过滤器过滤，在2°C保存，24小时内分析TPC和AA。
2.7. 总酚含量（TPC）
使用Folin–Ciocalteu法测定总酚。将100μL提取物与1.3mL Milli-Q水和0.3mL稀释的Folin–Ciocalteu试剂（1:2, v/v）混合。5分钟后，加入0.3mL 20% (w/v) Na2CO3。反应混合物在室温下孵育60分钟，在765nm处测量吸光度。结果根据Trolox标准曲线计算，以每克干重的Trolox当量毫克数（mg TE/g DW）表示。
2.8. DPPH自由基清除活性
使用DPPH法评估自由基清除能力。将50μL提取物与250μL醋酸盐缓冲液和甲醇混合，最终体积为1mL。最后，加入1mL 0.2mM DPPH的甲醇溶液。在黑暗中孵育1小时后，记录517nm处的吸光度。抗氧化活性使用Trolox标准曲线进行定量，以mg TE/g DW表示。
2.9. 提取物纯化
在LC–MS/MS分析之前，使用100mg Strata-X RP小柱对提取物进行纯化。依次用甲醇和水活化小柱。将稀释后的游离提取物（提取物:水 1:9, 30mL）或3mL水解提取物上样。用水洗涤并真空干燥后，用2mL 70%甲醇水溶液洗脱保留的化合物。洗脱液经0.20μm针式过滤器过滤，并在-80°C保存直至分析。
2.10. 液相色谱-质谱联用（LC–MS/MS）分析
采用反相液相色谱-串联质谱法进行分离和定量。使用ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统与Xevo TQ-S micro三重四极杆质谱仪联用。使用C18柱进行色谱分离，柱温35°C，进样体积2μL，流动相流速320μL/min。流动相组成为0.1%甲酸水溶液（溶液A）和乙腈（溶液B）。梯度洗脱程序为：0–4分钟，B相10%；4–18分钟，B相10–60%；18–18.2分钟，B相60–80%；18.2–20分钟，B相80%；20–20.2分钟，B相80–10%；20.2–26分钟，B相10%。检测在负离子模式下进行。
2.11. 面包特性
2.11.1. 比容
通过油菜籽置换法评估制备面包的比容。结果表示为面包体积与重量之比（mL/g）。
2.11.2. 面包皮颜色测量
使用色差计测量面包皮的三个颜色参数（L， a， b）。L表示明度（0为黑，100为白）；a表示绿-红色谱，负值表示绿色，正值表示红色；b表示蓝-黄色谱，负值表示蓝色，正值表示黄色。在面包皮表面取五个测量点并取平均值。
2.11.3. 质构分析
根据AACC方法74-09评估面包样品的质构。使用配备36mm圆柱形探头的质构分析仪进行分析。将面包样品切成25mm厚的切片，并使用40%变形的压缩测试分析面包屑质地。在烘烤后3小时（第0天）以及储存24小时和48小时后进行质地测量，以监测储存期间质构特性的变化。在受控条件下进行压缩测试，并使用得到的力-时间曲线评估质构参数。所有测量进行三次重复。
2.11.4. 感官评价
烘烤后3小时，由五名具有烘焙产品评估和描述性感官分析经验的评估员组成的训练有素的专家小组进行面包样品的感官评价。评估以分析质量评估而非消费者偏好研究的形式进行。每位参与者收到约2cm厚的代表性切片，并进行编码以确保公正评估。评估基于20分制，不同属性按比例贡献总分。评估参数包括形状和外观（1分）、表皮特性和外观（2分）、面包屑外观（4分）、结构和弹性（4分）以及香气和味道（9分）。小组成员检查面包的外部特征，重点关注其形状以及面包皮的外观和颜色。然后将面包切片以评估面包屑，观察颜色、孔隙率和孔隙均匀性。此外，还评估了每个样品的质地、面包屑弹性以及香气和味道。根据每个属性的强度和质量与对照面包进行比较进行评分。
2.12. 统计分析
所有实验使用完全随机化方法进行三次。所有斯佩耳特小麦提取物制备两次。数据报告为三次分析的平均值±标准差（SD）。结果进行双向方差分析，并使用Tukey多重比较检验确定平均值之间差异的显著性。所有检验使用SPSS统计软件（版本24）进行。统计显著性定义为p < 0.05水平。
结果与讨论
3.1. 萌芽对总酚含量和抗氧化活性的影响
使用Folin–Ciocalteu（FC）和DPPH法分别测定所有面包样品的甲醇提取物的总酚含量（TPC）和抗氧化活性（AA）。结果以Trolox当量表示（mg TE g?1干物质）并在原文Figure 1中呈现。
两种测定均显示，与对照相比，添加萌芽谷物的面包酚类含量和抗氧化活性显著更高，证实谷物萌芽促进了酚类化合物等生物活性代谢物的积累。酚类化合物和AA的增加通常与添加到面团中的萌芽谷物水平成正比。在所研究的谷物中，萌芽荞麦导致TPC和AA的增加最为显著。这与之前的研究一致，即荞麦在假谷物中具有最高的固有酚类潜力，且萌芽促进了芦丁、槲皮素衍生物和酚酸的积累。在本研究中，这种增加不仅体现在游离部分，也体现在结合酚类上，表明萌芽和随后的烘烤条件有助于部分释放与细胞壁组分相关的酚类物质。B60的总TPC达到近8 mg TE g?1，是对照的三倍以上增加。结合酚类的增加具有特别的营养重要性，因为这些化合物在消化过程中持续存在，并在结肠中发挥抗氧化作用，可能有助于肠道健康。萌芽燕麦也对TPC和AA的增强有显著贡献。与其他谷物相比，燕麦富含燕麦酰胺（AVN），这是一种燕麦特有的酚类生物碱，具有很强的自由基清除能力。O60样品的总TPC比对照高出约55%，表明燕麦萌芽有效提升了最终烘焙产品的抗氧化潜力。萌芽斯佩耳特小麦产生的改善较小但一致，可能是由于其与小麦的组成相似性，其酚类谱以阿魏酸和对香豆酸为主，主要以结合形式存在。游离酚类的增加有限，而结合酚类的增加表明萌芽过程中新生组织内酚类化合物的积累增强。多谷物面包的TPC和AA也显著高于对照。MG60样品的TPC比对照增加了一倍多，AA增加了约四倍。尽管效果不如富含荞麦的面包显著，但不同萌芽谷物的组合使用可能有助于产生更广泛的次生代谢物谱。Pearson相关分析显示，所有面包样品的总酚含量（FC测定）和抗氧化活性（DPPH测定）之间存在非常强的正相关关系（r = 0.92, p < 0.001, n = 72）。该结果证实，萌芽诱导的酚类化合物增加是抗氧化活性增强的主要因素。
3.2. 液相色谱-质谱联用（LC–MS/MS）对次生代谢物的表征
LC–MS/MS分析提供了面包样品游离和结合部分中单个酚类化合物和苯并噁唑啉酮的详细定量数据（见原文Table 2, Table 3, 及Figure 2）。
结果表明，添加萌芽谷物使面包的植物化学谱多样化和强化。生物活性化合物的类型和浓度与所使用的特定谷物直接相关，并随添加水平成比例增加。在富含萌芽斯佩耳特小麦的面包中，苯并噁唑啉酮是该谷物特有的主要化合物。2-苯并噁唑啉酮（BOA）和6-甲氧基-2-苯并噁唑啉酮（MBOA）仅在含斯佩耳特小麦的样品中检测到，其浓度呈剂量依赖性增加。S60面包的游离部分含有13.52 ± 0.90 μg/g DW的BOA和4.02 ± 0.53 μg/g DW的MBOA。苯并噁唑啉酮是斯佩耳特小麦和小麦等谷物中发现的次生代谢物；在未萌芽谷物中，它们含量极低或检测不到，因此在对照面包中未检测到，这与我们之前的发现一致。夏佛塔苷及其异构体的含量也相较于对照有所升高。这些化合物也转移到了多谷物面包中，证实了斯佩耳特小麦对整体植物化学库的贡献。除了游离的次生代谢物外，结合酚类物质（主要是阿魏酸（顺式和反式异构体）和反式-对香豆酸）在富含斯佩耳特小麦的面包中比对照显著更高，S60样品的含量最高（分别为190.71 ± 24.03 μg/g DW；38.39 ± 2.64 μg/g DW；和5.70 ± 0.73 μg/g DW）。含有萌芽裸燕麦的面包以含有燕麦酰胺A、B和C为特征。这些燕麦特有的化合物在游离部分中含量很高，并随燕麦添加水平成比例增加。O60面包含有12.38 ± 0.59 μg/g DW的AVN A；20.54 ± 1.21 μg/g DW的AVN B；和18.55 ± 1.91 μg/g DW的AVN C。这些化合物成功融入面包基质，凸显了使用萌芽裸燕麦增强烘焙产品功能价值的潜力。多谷物面包也含有可测量量的所有三种燕麦酰胺，MG60含有5.14 ± 0.27（AVN A）；7.54 ± 0.46（AVN B）；和6.50 ± 0.44（AVN C）μg/g DW，表明即使在混合配方中燕麦也做出了有效贡献。最多样化和最丰富的次生代谢物谱出现在含萌芽荞麦的面包中。B60面包的游离部分富含芦丁（35.11 ± 3.10 μg/g DW）、牡荆素（41.99 ± 1.88 μg/g DW）、荭草素（20.82 ± 1.12 μg/g DW）和异荭草素（23.74 ± 1.21 μg/g DW）。在荞麦萌芽过程中显著增加的表儿茶素，在B60样品中也检测到18.24 ± 1.88 μg/g DW。这些化合物的高浓度证实，萌芽过程有效提高了黄酮含量，并且其中很大一部分在烘烤过程中的热处理后得以保留。荞麦面包的结合部分含有较少但可检测量的荭草素、异荭草素和牡荆素。多谷物面包呈现出复合的植物化学谱，含有来自斯佩耳特小麦的苯并噁唑啉酮、来自燕麦的燕麦酰胺和来自荞麦的黄酮类化合物。这表明使用谷物混合物具有互补效应，使面包具有更广泛的次生代谢物谱。MG60面包同时含有BOA（5.42 μg/g DW）、AVN B（7.54 μg/g DW）和芦丁（11.81 μg/g DW）。这种多样性很可能拓宽了抗氧化机制的谱系，因为不同的酚类对自由基清除、还原能力和潜在的协同相互作用有不同的贡献。对照面包的谱图要简单得多，仅含有夏佛塔苷及其异构体、阿魏酸和对香豆酸等低本底水平的化合物。比较烘烤前面团样品和相应面包样品的LC–MS/MS谱图，显示出可比的次生代谢物组成，表明所应用的条件没有显著影响所鉴定化合物的存在。大多数生物活性化合物在烘烤后仍以可比浓度被检测到。例如，富含荞麦样品中的芦丁、牡荆素、荭草素和异荭草素仅显示中等程度的下降，表明对热降解具有相当的抗性。类似地，富含燕麦的面包中的燕麦酰胺A、B和C大部分得以保留。酚酸观察到的微小变化可能反映了热加工过程中部分降解和同时从结合形式释放。这些结果表明，面包制作过程并未显著损害次生代谢物的稳定性，这支持了在功能性烘焙产品中使用萌芽谷物的可行性。
3.3. 膳食纤维含量
面包样品的膳食纤维含量结果见原文Table 4。与对照面包相比，添加萌芽谷物显著增加了总膳食纤维（TDF）含量。由白小麦粉（T500）配制的对照面包的TDF含量为2.78 g/100g，这是传统白面包的典型值。添加30%萌芽谷物使TDF增加至4.05–4.32 g/100g的范围，比对照增加了约53–55%。60%的强化水平导致TDF进一步显著上升，数值范围为4.96至5.16 g/100g。这相当于比对照增加了78–86%，使纤维含量达到与许多全麦面包相当或更高的水平。这种增强是由不溶性膳食纤维（IDF）和可溶性膳食纤维（SDF）部分的增加共同驱动的。IDF含量从对照的2.16 g/100g增加到斯佩耳特小麦60样品中的最大值3.59 g/100g。这与萌芽全谷物的高麸皮含量一致，麸皮是纤维素和木质素等不溶性纤维的丰富来源。SDF部分也显著增加，从对照的0.62 g/100g增加到燕麦60样品中的超过1.80 g/100g——增加了近三倍。SDF的增加可归因于来自燕麦和斯佩耳特小麦的β-葡聚糖，以及萌芽过程中释放或合成的阿拉伯木聚糖和其他可溶性多糖。富含萌芽斯佩耳特小麦的面包显示出最高的IDF水平，而富含萌芽燕麦和荞麦的面包显示出最高的SDF含量。多谷物面包表现出平衡的纤维谱，有效结合了所有三种谷物类型的贡献。SDF/TDF比率也从对照的22%增加到大多数强化样品中的约30–36%，表明可溶性纤维的相对富集，这对益生元和血糖调节特性特别有益。
3.4. 面包特性
在原文Tab
