《Foods》：Microbial Fermentation as a Tool to Improve the Antioxidant and Functional Value of Milk Products
Sion Seol and
JuDong Yeo
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本文综述了微生物发酵通过重塑乳制品中的功能性成分（如生物活性肽、有机酸、多酚代谢物等），以增强其抗氧化能力及相关健康益处（抗糖尿病、抗炎、抗癌等）的核心机制，并强调需结合化学（ABTS/DPPH/FRAP）、细胞（ROS/NO）及动物（TBARS/MDA/SOD/CAT/GSH-Px/GSH）多维度评估体系，以及多组学（Metabolomics/Metagenomics/Proteomics）方法来全面理解其功能。
引言：发酵乳制品的抗氧化蓝图
氧化应激是糖尿病、癌症和心血管疾病等慢性疾病发生的重要因素。随着健康意识的提升，富含抗氧化剂的功能性食品日益受到关注。微生物发酵作为一种生物转化过程，能够通过微生物酶系统重塑食品基质中抗氧化剂和功能成分的化学结构，从而提升乳制品的整体抗氧化谱和生物利用度。这种变化主要通过两大途径实现：一是发酵诱导的蛋白水解产生生物活性肽；二是微生物将多酚生物转化为分子量更低、抗氧化潜力更强的衍生物。
微生物在乳制品发酵中的动态作用
乳制品的发酵是一个由微生物群落驱动、涉及多阶段演替和代谢互作的复杂过程，而不仅仅是简单的产酸。不同产品中的微生物生态系统各有特色：
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酸奶发酵：是嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）与德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）的共生体系。前者早期利用乳糖产酸降低pH，为后者创造适宜环境；后者则通过蛋白水解释放氨基酸和肽，支持包括嗜热链球菌在内的微生物生长，形成相互依赖的代谢关系，并最终形成特征性的凝胶结构和代谢物变化。
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奶酪发酵：在发酵早期，发酵剂乳酸菌主导产酸和凝乳。进入成熟阶段后，对酸和高盐条件更耐受的非发酵剂乳酸菌（如乳酸酪杆菌属）逐渐占据主导，发酵机制从以乳糖代谢为中心转向以蛋白质和脂质降解为中心，产生肽、游离氨基酸和脂肪酸等低分子代谢物，塑造了奶酪的风味与质地。
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酸奶油发酵：使用嗜热链球菌和德氏乳杆菌。随着发酵进行，耐酸性更强的德氏乳杆菌比例增加，在产酸的同时，其脂酶水解乳脂产生游离脂肪酸，后者进一步转化为醛、酮、醇、酯等挥发性化合物，形成酸奶油特有的风味。
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开菲尔发酵：构成一个乳酸菌与酵母菌共存的复杂生态系统，具有更高的代谢多样性。在发酵早期，以乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）为主的乳酸菌群利用乳糖产酸，同时启动蛋白水解。随着发酵进行，β-酪蛋白衍生的生物活性肽（如AVPYPQR, LVYPFPGPIPN, EMPFPK）被检测到，这些肽与ACE抑制等生理功能相关。在发酵后期，醋酸杆菌属（Acetobacter spp.）可能利用乳酸菌和酵母产生的天冬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）等生长。
聚焦肽的抗氧化与功能特性变化
发酵乳制品的抗氧化能力和功能特性因乳基质类型、所用微生物和分析方法而异。但一个普遍规律是，微生物蛋白水解会选择性积累源自β-酪蛋白的低分子量肽段。
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酸奶发酵：在动物模型中显示出减轻全身性氧化应激的益处。例如，在高脂饮食诱导的模型中，补充酸奶显著降低了血浆和肝脏中的丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和细胞凋亡（APOP）水平。在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病模型中，发酵酸奶也能显著减轻氧化损伤标志物（MDA）的升高，并恢复谷胱甘肽（GSH）水平，表明其可增强内源性氧化还原缓冲系统。
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混合菌群发酵乳：以开菲尔和马奶酒为例，其发酵过程驱动了肽和代谢物水平的协调重塑。在开菲尔中，微生物蛋白水解产生富含经典钙结合基序（SerP–SerP–SerP–Glu–Glu）的β-酪蛋白衍生磷酸肽。肽富集组分在体外表现出更高的铁还原抗氧化能力（FRAP），其中<10 kDa的肽段在果蝇阿尔茨海默病模型中显示出改善攀爬能力、减少β-淀粉样蛋白和神经退行性病变指标的效应。对马奶酒的代谢组学分析则揭示了代谢结构的广泛转变，包括丙酮酸、GABA和乙酰乙酸盐水平的升高，以及氨基酸代谢和氧化还原相关代谢通路的重编程。
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益生菌发酵乳：使用特定菌株（如植物乳杆菌T1或CSK）发酵的牛奶，其ABTS、DPPH和羟基自由基清除活性均有所提高。代谢组学分析显示代谢物谱发生了显著变化，特别是增加了有机酸和氨基酸。胞外多糖（EPS）作为发酵过程中分泌的一类重要后生元代谢物，其生物合成与碳水化合物利用和糖代谢通量直接相关，并与自由基清除和抗氧化活性相关。
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生物活性肽：在开菲尔、水牛发酵乳和奶酪等多种发酵乳基质中，均检测到β-酪蛋白衍生的抗氧化肽（如VLPVPQK）和ACE抑制肽（如EMPFPK）。在水牛发酵乳中鉴定出的新肽GG13，在LPS刺激的巨噬细胞模型中，能剂量依赖性地抑制NO和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌，并下调STAT1、iNOS、COX2等27种炎症相关蛋白。这些肽段通常含有与自由基清除潜力相关的氨基酸残基（如甲硫氨酸、组氨酸、脯氨酸）。
发酵乳制品抗氧化能力的多维度评估
发酵乳的抗氧化功能应通过整合化学、细胞和生物体水平的多维度评估框架来综合理解，而非依赖单一指标。
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化学抗氧化能力：常用体外化学法评估，包括基于自由基清除的ABTS、DPPH、羟基自由基清除活性，以及基于还原能力的FRAP测定。ABTS和DPPH主要用于评估对稳定自由基的清除能力，而FRAP则反映通过金属离子还原体现的电子给予能力。这些方法使用的人工自由基与生理条件差异显著，且各自仅能捕捉抗氧化作用的有限方面。
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细胞抗氧化效应：为克服体外测定局限，常采用LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞模型，以ROS或NO生成的减少作为指标，间接验证发酵乳成分的细胞抗氧化潜力。研究表明，发酵过程中高分子量蛋白减少，而低分子量肽（特别是低于3 kDa范围）选择性积累。pH的改变和有机酸的存在可能通过调节蛋白质结构与配体的结合、协同增强抗氧化效应或激活内源性抗氧化防御系统（如SOD、CAT、POD），间接缓解氧化应激。
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体内生物学相关性：动物模型中，通常通过测量硫代巴比妥酸反应物（TBARS）来评估脂质过氧化损伤。同时，评估内源性抗氧化防御系统（如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px和谷胱甘肽GSH）的变化。SOD催化超氧阴离子（O2•?）转化为过氧化氢（H2O2），CAT进一步将H2O2分解为水和氧气，而GSH则是直接清除ROS的核心内源性抗氧化剂。当氧化损伤指标（TBARS/MDA）与内源性防御系统（SOD、CAT、GSH-Px、GSH）的调节数据一同呈现时，发酵乳的抗氧化效应便具备了更强的生物学合理性。
发酵乳制品的多重健康益处
发酵乳制品的生物活性可归纳为以下几类：代谢疾病相关功能、炎症调节、抗癌活性及抗色素沉着过度效应。
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代谢疾病相关功能：摄入发酵乳可降低促炎细胞因子并重塑肠道菌群组成，从而缓解炎症-氧化应激轴。在诱发结直肠肿瘤形成的大鼠模型中，开菲尔摄入显著减少了肿瘤数量，并降低了IL-1β、IL-6、TNF-α和NO等关键炎症介质水平。使用产EPS的植物乳杆菌DPA1C制成的酸奶也显示出α-葡萄糖苷酶抑制活性及对肠道菌群组成的调节作用。
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炎症调节：发酵过程中产生的低分子量生物活性肽，可通过作用于血压调节的关键靶点酶（如ACE）来发挥功能。源自乳酸菌发酵乳的脂肪酸组分能在LPS刺激的RAW264.7细胞中降低TNF-α和IL-6水平，同时增加抗炎因子IL-10的分泌，这与抑制MAPK和NF-κB信号通路有关。驴奶发酵产生的抗炎肽（以低于3 kDa的肽段为主）能减少LPS刺激的RAW264.7细胞中NO的产生，其中肽段HN-17通过与诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的氢键和疏水相互作用，可能抑制该酶活性。
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抗癌活性：源自奶酪的乳酸菌菌株（如发酵粘液乳杆菌C9和植物乳杆菌C47）的细胞游离分泌液或蛋白质类代谢物，可选择性抑制口腔癌细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，其机制涉及对凋亡相关信号（如SMAC表达增加，SURVIVIN表达减少）的调控。
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抗色素沉着过度效应：使用瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）生产的乳清能减少B16黑色素瘤细胞中的黑色素积累，并降低酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1和多巴色素互变异构酶等关键黑色素生成酶的表达。有趣的是，从该乳清中分离的细胞外囊泡（EVs）也显示出抑制黑色素生成的效果，而来自对应细菌培养物或牛奶的EVs则无此效应。
结论
综上所述，发酵乳制品的功能特性应理解为发酵在乳基质内驱动的肽、代谢物、有机酸和生理活性因子分子重组的结果，而非单一抗氧化成分或个别分析结果的产物。未来，需要通过结合微生物菌株特异性、发酵条件和基质降解相互作用的多组学方法，超越简单的抗氧化能力评估，来更精确地界定发酵乳制品的功能。
