《International Journal of Molecular Sciences》：Molecular Characterization of Soft Tissue Sarcomas Using RNA-Based Next-Generation Sequencing
Bogdan Serban,
Adrian Cursaru,
Sergiu Iordache,
Bogdan Cretu,
Mihai Nica,
Georgian Iacobescu,
Mihnea Popa,
Eugen Radu,
Madalina Cirnu and
Catalin Cirstoiu
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本研究通过RNA测序（RNA-NGS）对软组织肉瘤（STS）进行分子表征，揭示了与肿瘤侵袭性相关的核心转录组特征，包括增殖基因（TOP2A、MKI67）、细胞外基质（COL11A1、SPP1）及发育调节因子（HOXD13、MELK）的过表达，并检出SS18::SSX1等临床相关融合，为STS的精准诊断与治疗提供了新见解。
1. 引言
软组织肉瘤（Soft Tissue Sarcomas, STS）是一组罕见且生物学特性多样的恶性间叶组织肿瘤，约占所有成人恶性肿瘤的1%。其显著的异质性不仅体现在组织学上，还涉及复杂的遗传和表型改变，这给准确诊断、预后分层和治疗决策带来了巨大挑战。虽然组织病理学检查和免疫组化（HP/IHC）仍是诊断的基石，但这些常规方法往往难以充分反映STS潜在的分子复杂性，特别是在形态学特征重叠或免疫表型不明确的肿瘤中。
基于我们在肿瘤边缘浸润和免疫标志物预后价值方面的先前工作，本研究利用RNA测序（RNA-based NGS, RNA-NGS）技术探索STS潜在的分子和转录组改变。尽管分子生物学进展已将分子改变纳入世界卫生组织（WHO）分类，但分子诊断在临床实践中的常规应用仍然有限，且标准化的分子诊断和预后评估算法尚未建立。因此，治疗策略通常主要依赖于临床病理学标准。
在此背景下，RNA-NGS技术成为一种强大的综合性分子分析平台，能够同时评估基因表达模式、单核苷酸变异、插入/缺失以及致癌基因融合。RNA-NGS尤其具有独特优势，可捕获具有潜在诊断、预后或治疗相关性的转录活性改变，包括融合事件和失调的信号通路。本研究旨在利用RNA-NGS探索STS的转录组图谱，聚焦于识别生物学相关的表达谱和具有临床意义的融合事件。
2. 结果
2.1. 分析A：STS总体转录组特征
为评估全局转录组谱是否能够区分肉瘤亚型，研究进行了无监督主成分分析（PCA）。前两个主成分解释了总方差的41%。平滑肌肉瘤（Leiomyosarcoma）样本在PC1/PC2轴上与其他肉瘤亚型呈现中度分离，但某些亚型间存在重叠的聚类，反映了高级别肉瘤间共享的增殖和致癌特征。
通过火山图和热图分析，研究鉴定出STS样本相对于对照组织（脂肪和骨骼肌）显著差异表达的基因。其中上调最显著的基因包括与增殖相关的基因（如TOP2A、MKI67、BUB1B）、细胞外基质和微环境相关基因（如COL11A1、SPP1）以及发育调节因子（如HOXD13、MELK）。此外，BCL6、CNBP、TPM3、SSX1等基因也位列前50个差异表达基因之中。
在检测到的变异中，单核苷酸多态性（SNPs）是主要的变异类型，每个样本检测到的变异总数在620到1377之间，转换/颠换（Ti/Tv）比值介于3.13和3.69之间，符合高质量RNA测序数据的预期分布。
2.2. 分析B：平滑肌肉瘤亚组分析
针对平滑肌肉瘤与对照的对比分析（分析B）显示，FN1、CDH1、FGFR2、CDC25C、MELK、COL11A1等基因显著过表达。同时，MACROD1、TACC2、TPM3、TOP2A等基因也表现出明显的差异表达，这揭示了平滑肌肉瘤特异的转录组特征。
2.3. 分析C：不同STS亚型间比较
由于亚组样本量有限，分析C（平滑肌肉瘤与其他STS亚型的比较）被视为探索性分析。其中过表达最显著的基因包括AKAP6、MYCL、CACNA1S、RYR1、NEB等。
2.4. 分子发现的整合概述
RNA-NGS揭示了一个复杂的转录组景观，其特征是参与增殖、有丝分裂调控、细胞外基质重塑和发育信号通路的基因失调。这些分子改变在整个队列和特定肉瘤亚型中均有观察到，突显了驱动软组织肉瘤生物学的共享和亚型特异性转录程序。
除了过表达的转录本，研究还发现了显著下调的基因（调整后p值 < 0.05；log2倍数变化 < -5）。其中下调最显著的基因包括参与结构维持和肌肉分化的CKM、MYH7、NEB和ACTA1，这表明肉瘤进展可能不仅涉及增殖激活，还包括组织分化程序和结构调控通路的抑制。
RNA融合检测在队列中发现了多个融合事件。在滑膜肉瘤样本中检测到经典的SS18::SSX1融合，证实了RNA-NGS方法的诊断稳健性。其他复发性融合包括HMGA2::C9orf16和FRS2::MDM2。这些发现凸显了靶向RNA测序捕获临床相关融合事件和扩增相关重排的能力。
3. 讨论
本研究的核心发现是增殖相关基因（TOP2A、MKI67、BUB1B）的持续过表达。TOP2A过表达与有丝分裂活性增加、基因组不稳定性和不良临床结局相关，并可能与蒽环类化疗反应相关，具有潜在的预测价值。MKI67过表达反映了高增殖活性，与FNCLCC分级、转移潜能和总生存期降低相关。有丝分裂检查点关键调节因子BUB1B的失调与染色体不稳定性相关。转录组评估可能比传统组织病理学评估提供更客观、定量的肿瘤侵袭性指标。
细胞外基质（ECM）相关基因也显著失调。COL11A1成为最持续过表达的基因之一，与肿瘤基质活化相关，其过表达与侵袭性增强、治疗抵抗和不良预后相关。SPP1（骨桥蛋白）的过表达进一步支持了肿瘤微环境在肉瘤侵袭性中的作用，与细胞迁移、血管生成和转移潜能增强相关。这些发现表明，ECM重塑和微环境信号传导是肉瘤进展的关键因素。
发育和转录调节因子也发生失调。HOXD13作为HOX基因家族成员，与肉瘤中异常的间质分化和发育通路再激活有关，其过表达与正常组织特性丧失和肿瘤侵袭性增加相关。这强化了肉瘤利用胚胎转录程序维持恶性行为的观点。
SSX1的过表达和经典SS18::SSX1融合的检测验证了RNA-NGS方法的稳健性。该融合是滑膜肉瘤的病理特征，并在表观遗传失调和转录重编程中起核心作用。此外，MELK、TPM3和BCL6等其他失调基因进一步阐明了STS的分子复杂性。MELK过表达与高级别肉瘤的干性、增殖和治疗抵抗相关；TPM3与细胞骨架组织和细胞运动有关；异常的BCL6表达可能有助于转录抑制和凋亡逃逸。
总而言之，RNA-NGS为软组织肉瘤的分子图谱提供了具有临床意义的见解，能够同时评估基因表达模式和致癌融合。将转录组分析整合到常规诊断流程中，可以优化肉瘤分类、改进预后分层并识别新的治疗靶点，支持在这一具有挑战性的恶性肿瘤群体中实施精准肿瘤学方法。
4. 材料与方法
本研究为观察性队列研究，纳入了24例经组织病理学和免疫组化确诊的软组织肉瘤患者。对照组包括脂肪和骨骼肌组织样本。所有样本的总RNA输入量在11.2–12.2 ng之间，RNA完整性数（RIN）≥ 5，DV200值≥50%。使用TruSight RNA Pan-Cancer Panel制备文库，并在Illumina MiniSeq平台上进行测序（2 × 75 bp双端）。平均测序深度为每样本280万条读长，平均目标覆盖度为403×，质量指标Q30百分比平均为90.01%。
队列包含4例平滑肌肉瘤、4例滑膜肉瘤、4例脂肪肉瘤、4例未分化多形性肉瘤、2例血管肉瘤、2例横纹肌肉瘤、2例纤维肉瘤和2例上皮样肉瘤。对照组包括2例脂肪组织和2例骨骼肌组织。
5. 结论与局限性
5.1. 结论
本研究证明，RNA-NGS是表征软组织肉瘤分子特征的稳健且具有临床相关性的方法。通过整合转录组分析和融合基因检测，RNA-NGS识别出与肿瘤增殖、细胞外基质重塑和异常发育信号通路相关的关键分子改变。增殖相关基因、基质/微环境相关基因以及转录调节因子的一致性过表达，突显了在显著的组织学异质性背后，驱动肉瘤侵袭性的趋同生物学机制。此外，临床相关基因融合的检测，证明了RNA-NGS超越常规组织病理学和免疫组化的诊断准确性和附加价值。
5.2. 局限性
本研究的局限性包括：样本量相对较小且软组织肉瘤亚型存在固有异质性，可能限制研究结果的普适性；分析的回顾性性质阻碍了对所识别分子改变与治疗反应和长期生存结果之间预测价值的直接评估；未对失调基因和融合事件进行功能验证；RNA测序本身无法检测结构基因组重排、拷贝数变异或表观遗传修饰，因此某些基因失活机制可能无法被检测到。研究中所鉴定的差异表达基因应被视为候选转录组标志物，而非已验证的分子靶点，未来需要在更大的前瞻性队列中使用正交技术进行独立验证。
