《Microorganisms》：Molecular Characterization of Pathogenic Avian Reovirus Circulating in Clinically Affected Chickens in Southeastern China (2022–2023) and Its Immunosuppressive Interference with Fowl Adenovirus Serotype 4 Vaccination
Xiaojian Chen,
Yazheng Chen,
Shenghua Yang,
Yanhua Xu,
Xuesong Li,
Zhanxin Wang,
Lijuan Yin and
Wencheng Lin
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本研究结合流行病学监测、分子表征与动物实验，系统揭示了禽呼肠孤病毒（ARV）的流行特点及其对异源疫苗免疫的干扰。研究发现，田间流行ARV毒株与经典疫苗株存在显著遗传差异，且先期ARV感染可显著削弱鸡对禽腺病毒血清4型（FAdV-4）灭活疫苗的体液免疫应答，降低疫苗保护效力，并加剧FAdV-4攻毒后的病理损伤。这为优化禽类疫病综合防控策略提供了实验依据。
引言：禽呼肠孤病毒与家禽健康挑战
禽呼肠孤病毒（Avian reovirus, ARV）是一种在商品化家禽生产中普遍存在的病原体，传统上与病毒性关节炎、吸收障碍综合征和生长迟缓相关。作为一种遗传多样的无包膜双链RNA病毒，ARV属于正呼肠孤病毒属。其基因组S1节段编码的十型蛋白（σC）负责介导病毒与宿主细胞的附着，是进行分子流行病学监测和基因分型的常用靶标。近年来，ARV的快速遗传分化引发了越来越多的担忧，特别是在已接种疫苗的鸡群中，可能出现疫苗毒株与流行毒株不匹配、免疫失调以及复杂的疾病结局。同时，禽腺病毒血清4型（fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4）是引发肝炎-心包积液综合征（HHS）的主要病原，给家禽业造成重大经济损失。田间调查发现，FAdV-4疫情的暴发常伴有ARV的早期感染迹象，这提示ARV的免疫抑制特性可能干扰针对FAdV-4的疫苗免疫保护效果。因此，本研究旨在通过整合大规模的田间监测、分子特征分析以及受控的动物实验，阐明ARV的流行病学特征及其对异源疫苗诱导的保护力的影响。
材料与方法：从田间到实验室的系统研究
本研究于2022年7月至2023年12月期间，从中国福建、广东和广西三省呈现病毒性关节炎/腱鞘炎、生长迟缓或疑似免疫抑制临床症状的139个商品肉鸡群中，共收集了958份临床样本。通过实时荧光定量PCR（targeting M1 gene）检测ARV，并从中成功分离到16株ARV毒株。代表毒株GX-742-2022（属于基因II型）在LMH（Leghorn male hepatoma）细胞系中进行分离和培养，细胞病变效应（CPE）表现为多核合胞体形成。通过扩增全长σC基因并进行测序，与16株参考毒株进行遗传进化分析。所有动物实验均遵循伦理规范，使用无特定病原体（SPF）鸡胚和鸡只进行。
研究设计了两个核心实验模型。模型一用于评估ARV（GX-742-2022）的致病性：包括对5日龄SPF鸡胚的卵内致病性试验以及对5日龄肉鸡的致病性试验，观察临床病变并采集胫跗关节和肌腱进行组织病理学检查。模型二是一个精心设计的“感染-疫苗接种-攻毒”干扰模型，用于评估先期ARV感染对FAdV-4疫苗免疫的干扰作用。将5日龄SPF鸡随机分为四组：I组（ARV感染 + FAdV-4疫苗接种 + FAdV-4攻毒）、II组（仅FAdV-4疫苗接种 + 攻毒）、III组（仅FAdV-4攻毒）和IV组（对照组）。在预定时间点采集血清，通过ELISA方法检测FAdV-4特异性抗体水平。所有鸡只在28日龄时用强毒FAdV-4毒株HN1605进行攻毒，随后监测死亡率、肝脏病毒载量（通过qPCR定量）以及心脏和肝脏的肉眼与组织病理学病变（采用半定量评分系统）。
结果：流行病学特征、遗传多样性与免疫干扰证据
1. 流行与遗传特征
流行病学监测显示，ARV在调查区域的商品鸡群中广泛循环。广东省的分离率最高，其次是福建和广西。大多数阳性样本来自10-20日龄的鸡只，未发现显著的季节性聚集模式。基于σC基因的遗传进化分析将16株田间分离株划分为三个基因型：I型（4株）、II型（9株）和VI型（3株），其中基因II型为优势流行基因型。重要的是，分析表明当前流行的田间毒株与经典疫苗株在σC基因水平上存在明显的遗传分化，这提示疫苗的交叉保护效果可能面临挑战。
2. ARV的致病性
代表毒株GX-742-2022在SPF鸡胚中表现出高致病性，导致胚胎生长迟缓、全身充血出血，并在接种后5天内引起100%死亡率。在肉鸡中，该毒株感染导致典型的病毒性关节炎病变：28天后，感染鸡出现胫跗关节明显肿胀、关节腔内出血。组织病理学检查显示，腓肠肌腱结构严重破坏，出现局灶性坏死、结缔组织增生以及以淋巴细胞和巨噬细胞为主的炎性细胞浸润。这些病变证实了GX-742-2022对肌肉骨骼系统的靶向致病性。
3. ARV对FAdV-4疫苗免疫的干扰
这是本研究的核心发现。在“感染-疫苗接种-攻毒”模型中，先期感染ARV显著削弱了针对FAdV-4的疫苗免疫应答和保护效果：
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体液免疫应答受损：与仅接种疫苗的II组相比，先感染ARV再接种疫苗的I组鸡只，在接种后14天和21天的血清FAdV-4特异性抗体水平均显著降低。
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疫苗保护效力下降：FAdV-4攻毒后，仅接种疫苗的II组鸡只受到完全保护，死亡率为0%。而先感染ARV的I组鸡只，累积死亡率达到50%，表明疫苗保护效力出现部分丧失。仅攻毒的III组死亡率为100%。
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病毒复制增强与病理损伤加剧：攻毒后，I组鸡只肝脏中的FAdV-4病毒载量显著高于II组。肉眼和组织病理学病变评分也显示，I组鸡只出现了明显的心包积液、肝脏肿大、心肌坏死和肝细胞多灶性坏死等病变，其严重程度虽低于III组，但显著重于受到完全保护的II组。对照组（IV组）则无任何病变。
讨论与意义：对家禽疫病防控的启示
本研究通过系统的田间监测和严谨的实验设计证实，当前在中国华南地区商品鸡群中，基因II型ARV广泛流行，且与疫苗株存在遗传差异。更重要的是，研究提供了定量的实验证据，表明在受控条件下，先期的ARV感染可以作为疫苗免疫反应的“调节者”，定向削弱针对另一种重要病原FAdV-4的灭活疫苗所诱导的体液免疫和保护效力，从而导致攻毒后死亡率升高、病毒复制增加和病理损伤加剧。
其机制可能涉及ARV感染导致的淋巴组织损伤、细胞因子和干扰素信号通路干扰等，这些免疫抑制效应创造了一个不利于后续疫苗激发最佳免疫应答的环境。尽管本研究主要评估了体液免疫层面的干扰，且实验条件旨在证明生物学上的合理性和方向性，而非完全模拟复杂的田间环境，但其发现具有重要的实践意义。
这项研究强调，在家禽生产体系中，普遍存在的ARV感染可能构成一个“隐性威胁”，影响针对其他关键病原（如FAdV-4）的疫苗接种效果。因此，在制定疫病防控策略时，不能仅着眼于单一病原的疫苗接种，而应采用综合管理的视角。这包括：加强针对流行ARV基因型的监测、优化疫苗免疫程序和时间、改善生物安全措施以降低早期感染压力，以及考虑更新疫苗毒株以匹配流行株。未来需要进一步研究不同ARV基因型、共感染模式以及更详细的免疫学机制，以更全面地评估ARV介导的免疫干扰在田间条件下的实际影响，并为家禽健康管理提供更精准的解决方案。
