《Microorganisms》：Dietary Changes Are Associated with Seasonal Restructuring of the Gut Microbiome in Cervus nippon kopschi
Yang Zhang,
Tianxiang Zhang,
Manyu Zhang,
Yumeng Jia and
Xiaofeng Huang
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本文综合运用DNA元条形码技术与16S rRNA基因测序，首次系统阐明了华南梅花鹿（Cervus nippon kopschi）肠道微生物组的季节性功能重组。研究揭示了其微生物组代谢潜能（如脂肪酸代谢、氨基酸降解、TCA循环、糖酵解等通路）随食物营养成分和气候因子动态变化，为理解野生食草动物如何通过“饮食-微生物组-宿主”轴适应环境季节性挑战提供了新见解。
引言：探索季节性饮食变化对肠道微生物组的影响
肠道微生物组是一个位于胃肠道内复杂而动态的微生物生态系统，对宿主生物学、健康和进化过程至关重要。这个由细菌、古菌、真菌和病毒组成的复杂群落与宿主形成共生关系，执行宿主基因组无法独立完成的基本功能。其组成和功能受到宿主内在因素和环境变量的影响。在环境因素中，饮食对肠道微生物组的结构和功能有着深刻的影响。季节性代表了一种显著且可预测的环境变化形式，深刻影响野生动物的生理和行为。季节性温度、降水和光周期变化调节动植物生命周期，导致资源可用性和质量发生巨大变化。因此，许多动物被迫改变其觅食策略、饮食和代谢过程，以确保全年的生存和繁殖成功。这些季节性饮食变化预计会引发肠道微生物组相应的周期性改变。草食性哺乳动物为研究“饮食-微生物组轴”的季节性动态提供了独特的机会，因为它们依赖富含复杂碳水化合物的植物物质，这需要与肠道微生物建立共生关系以促进能量提取。这些哺乳动物面临的营养环境随季节变化显著。在生长季节，它们能获得丰富、营养密集的饲料，如嫩叶、嫩芽和花朵，这些饲料蛋白质和可消化碳水化合物含量高。相反，休眠季节的特点是食物稀缺，迫使这些动物依赖质量较低、高纤维的食物，如成熟叶片、嫩枝和树皮。为适应此变化，食草动物需要灵活的消化生理机能，这主要受其肠道微生物组适应能力的驱动。华南梅花鹿是长江中下游流域特有的濒危亚种，是探索这些季节性适应的绝佳模型。该地区拥有鲜明的季节特征，为梅花鹿提供了周期性变化的环境和食物供应。本研究对野生华南梅花鹿种群进行了为期一年的调查，通过DNA元条形码技术和16S rRNA基因测序，表征了它们在四个季节的饮食和肠道微生物组。我们的目标是阐明肠道微生物组季节性变化的功能性后果，验证关于微生物组组成和功能潜力上不同季节性模式与饮食变化相对应的假设。
材料与方法：样品采集与分析流程
研究在江西桃红岭梅花鹿国家级自然保护区进行，于2022年10月至2023年7月的四个季节收集了野生梅花鹿的新鲜粪便样本。每个季节（冬季1月、春季4月、夏季7月、秋季10月）收集15份样本，总计60份。样本采集后立即在液氮中冷冻，使用干冰运输至实验室，并储存在-80°C超低温冰箱中以待后续DNA提取。使用试剂盒提取总微生物和植物DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计评估DNA质量和浓度。
对于肠道微生物组分析，使用针对细菌16S rRNA基因V3-V4区的引物（338F/806R）进行PCR扩增。扩增产物纯化后，在Illumina NovaSeq平台上进行双端测序。对于饮食分析，则利用叶绿体rbcL区域进行DNA元条形码分析，使用特定引物（rbcL-F/rbcL-R）进行PCR扩增，并在同一测序平台进行测序。此外，为识别粪便样本中的植物序列，建立了涵盖保护区232种最常见植物的综合DNA参考数据库。
测序数据处理在QIIME2（v2019.4）中进行。原始序列经解复用、引物修剪、质量过滤、去噪、合并和去除嵌合体后，生成ASV（扩增子序列变体）特征序列和丰度表。使用Greengenes（v13_8）参考数据库对ASV进行物种注释，并使用PICRUSt2（v2.5.2）工具预测微生物群落的功能潜能，推测MetaCyc代谢途径的丰度。同时，从中国国家气象局获取采样点的气温和降水量数据，并对梅花鹿各季节主要采食的前十种植物叶片进行粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、磷和钙的化学成分分析。
统计分析利用QIIME2和R包进行。通过α多样性指数（如Chao1、Shannon、Pielou均匀度指数）和β多样性分析评估群落结构和差异，其中β多样性使用Bray-Curtis距离并通过主坐标分析（PCoA）可视化。通过PERMANOVA检验组间差异的显著性。利用冗余分析（RDA）和方差分解分析（VPA）量化环境因素对肠道菌群的影响，并运用MaAsLin3分析识别不同季节间显著富集的代谢通路。
结果：饮食与微生物组的季节性动态
1. 饮食多样性和组成的季节性变化
研究共获得了5,962,315条高质量序列，对应57个植物科、76个属和79个物种。饮食组成表现出显著的季节性差异。PERMANOVA分析证实，所有季节对之间的饮食组成均存在显著差异，其中秋季和冬季之间的差异最大（R2= 0.5768）。主坐标分析（PCoA）结果直观地支持了这种差异，夏、秋、冬样本的置信椭圆清晰分离，春季椭圆虽与夏季和冬季部分重叠，但其独特的质心位置证实了其独特的饮食特征。
季节性饮食α多样性在所有指标上均表现明显。Chao1指数显示夏季的物种丰富度显著高于春季。相反，Shannon指数和Pielou均匀度指数均表明，春季和夏季的饮食均匀度明显高于秋季。这些模式表明，夏季是饮食物种丰富度的峰值季节，春季和夏季的饮食资源利用更为均衡，而秋季的饮食均匀度较低。
在科水平上，核心饮食成分呈现明显变化。春季以蔷薇科和壳斗科为主，禾本科也占一定比例。夏季饮食主要包括壳斗科、蔷薇科和蓼科。秋季饮食明显转向金缕梅科、蔷薇科和菝葜科。冬季饮食则主要回归蔷薇科，并伴有莎草科和桑科。指示性植物物种分析显示，蔷薇科在春季和冬季普遍存在，金缕梅科是秋季的指示科，而豆科是夏季的指示科。元条形码分析表明，梅花鹿在觅食策略上表现出显著的季节性可塑性。
2. 肠道菌群多样性和组成的季节性变化
肠道菌群共获得2,658,841条高质量序列。β多样性分析（PCoA，PC1: 20.8%， PC2: 10.5%）揭示了清晰的季节性聚类。春季和冬季的置信椭圆彼此分离，也与夏季分离。然而，春季、夏季和秋季椭圆的相互重叠表明，在这些温暖季节中存在成分上的连续性。PERMANOVA分析统计证实了所有季节对之间的组成存在显著差异，其中夏季与冬季之间（R2= 0.2399）以及春季与冬季之间（R2= 0.2008）的差异最大。
肠道菌群的α多样性呈现出明显的季节性动态。对Chao1指数的分析显示，微生物丰富度存在显著变化：夏季的微生物丰富度显著高于春季和冬季。在群落多样性和均匀度方面，Shannon指数和Pielou均匀度指数均表现出一致的季节性模式。夏季的Shannon指数显著高于春季和冬季。Pielou均匀度指数也显示，夏季的值显著高于春季和冬季。总之，这些结果表明，与其他季节相比，夏季拥有最丰富、最多样化且结构最均匀的肠道微生物群落，而春季和冬季的微生物多样性、丰富度和均匀度普遍较低。
分类学组成在不同季节和不同分类水平上存在显著差异。厚壁菌门是所有季节中的优势门，尤其是春季、夏季和秋季的指示性门。相比之下，冬季的特点是变形菌门的显著增加，成为其指示性门。在科水平上，瘤胃球菌科是温暖季节（春、夏、秋）的核心指示科。在冬季，典型的发酵菌科数量减少，而莫拉菌科和假单胞菌科（均属变形菌门）显著增加，成为优势和指示性类群。总之，梅花鹿的肠道菌群表现出与饮食和环境时间变化相关的显著季节性变异。
3. 环境因素对肠道菌群季节性变异的影响
在季节中，夏季的气温和降水量最高，而冬季的气温最低，秋季的降水量最少。饲料植物中粗蛋白、粗脂肪和钙的浓度在夏季达到峰值；粗蛋白、粗纤维和磷在冬季含量最高；而所有五种营养素的数值在秋季均最低。基于ASV表的冗余分析（RDA）评估了环境因素对肠道菌群的影响。气候变量（温度和降水）以及五种膳食成分（粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、钙、磷）均显著影响梅花鹿肠道菌群的季节性变化。向量方向、样本分布和Mantel检验结果共同支持了这些外部因素在塑造微生物群落组成中的重要作用。温度向量与春、夏季及部分秋季样本形成锐角，而降水向量与春、夏季样本形成锐角。粗蛋白、粗纤维、钙和磷的向量与冬季样本密切相关。此外，使用“varpart”程序进行的方差分解分析量化了环境因素对细菌群落变异的相对贡献。温度、降水和膳食营养成分分别独立解释了总方差的0.67%、0.75%和12.02%。温度与膳食营养成分的交互作用解释了1.38%的方差，而降水与膳食营养成分的结合解释了3.17%。VPA表明，气候和饮食变量仅解释了肠道菌群变异的一小部分，大部分变异仍无法解释，可能反映了未测量的宿主和环境因素以及方法学限制。
4. 肠道微生物功能的季节性变异
基于从16S rRNA测序数据推断出的酶学编号相对丰度计算Bray-Curtis距离进行PCoA分析，结果显示不同季节的个体之间存在分离。Anosim检验揭示了四个季节组之间存在显著差异。在冬季，个体显示与大分子修饰相关的基因富集程度最高，显著高于夏季和秋季。相反，在夏季和秋季，与聚糖生物合成途径相关的基因富集程度最高，表现为冬季的富集水平显著低于秋季、夏季和春季。此外，与代谢簇相关的基因在秋季和夏季富集最高，冬季的富集则显著低于秋季。基于二级MetaCyc通路相对丰度的聚类热图表明，春季和夏季的个体（生长季）聚集在一起，而秋季和冬季的个体（休眠季）形成另一个独立的簇。值得注意的是，与辅助因子、辅基、电子载体和维生素生物合成，脂肪酸和脂质生物合成以及TCA循环相关的通路在冬季个体中显著富集，高于春、夏、秋三季。
5. 主要营养代谢通路的季节性变异
主要营养代谢通路，包括氨基酸生物合成、氨基酸降解、脂肪酸和脂质生物合成、脂肪酸和脂质降解、糖酵解和三羧酸循环，均已得到注释。冬季氨基酸降解、脂肪酸和脂质生物合成、脂肪酸和脂质降解以及TCA循环的相对丰度显著高于春、夏、秋三季。相反，冬季糖酵解通路的相对丰度显著低于春季和夏季。基于这些营养代谢通路相对丰度的聚类热图显示，春季、夏季和秋季的个体聚集在一起，而冬季个体则形成一个独立的簇。这些发现与冬季在脂肪酸和脂质生物合成、脂肪酸和脂质降解、氨基酸降解和TCA循环通路上的显著富集一致。相比之下，春季和夏季的个体在糖酵解和氨基酸生物合成通路上表现出显著富集。同时，秋季个体在所有通路上的相对丰度都较低。此外，通过MaAsLin3分析识别了在不同季节梅花鹿中显著富集的三级代谢活跃通路。该分析揭示了不同的季节性代谢特征。冬季代谢的特征是靶向合成代谢和显著分解代谢的双重特征。富集的通路包括分解代谢过程，如L-精氨酸降解II、脂肪酸生物合成起始超级通路、鸟氨酸降解超级通路、L-精氨酸、腐胺和4-氨基丁酸降解超级通路、L-精氨酸和L-鸟氨酸降解超级通路、L-亮氨酸降解I、L-酪氨酸降解I和L-组氨酸降解。同时，还原性TCA循环、L-苯丙氨酸生物合成超级通路、L-酪氨酸生物合成超级通路和L-丙氨酸生物合成超级通路等合成代谢通路也富集。这表明了一种氨基酸分解代谢供能与持续合成特定氨基酸相平衡的代谢状态。春季显示出向氨基酸分解代谢和硫代谢的转变，L-精氨酸降解II、脂肪酸生物合成起始超级通路、鸟氨酸降解超级通路和硫糖酵解显著富集。有趣的是，春季也以合成代谢通路的并发富集为标志，包括L-色氨酸生物合成超级通路、L-苯丙氨酸生物合成超级通路和L-酪氨酸生物合成超级通路，表明此季节转换期间存在复杂的代谢重塑。夏季个体表现出更特异的代谢特征，主要富集L-色氨酸生物合成超级通路和L-蛋氨酸挽救循环III。
讨论：适应性意义与研究展望
1. 饮食-微生物组轴作为季节性适应的驱动力
饮食对肠道微生物组的深远影响是微生物生态学中一个公认的原则。我们的研究结果证实了这一原则，表明梅花鹿饮食的季节性变化反映在其肠道微生物群落的改变上。从夏季多样化、富含蛋白质（豆科植物相对丰度较高）的饮食，转变为冬季更具纤维性、质量较低（蔷薇科植物比例增加）的饮食，这与微生物多样性和分类组成的变化相关。这种模式与从灵长类动物、其他大型食草动物到鸟类等一系列野生动物的观察结果一致，突出了一个普遍的生态学原理。全年厚壁菌门和拟杆菌门的持续优势是食草动物的典型特征，反映了它们在消化复杂植物多糖方面的关键作用。然而，变形菌门的季节性增加值得注意，其在人类中常与菌群失调相关，但在营养胁迫时期在野生动物中的升高可能预示着一种潜在的适应性反应，可能与休眠季节所需的特定代谢需求有关。
我们的方差分解分析表明，饮食解释了微生物群落组成变异的12.02%，这一比例大于仅由气候变量解释的部分。这些结果表明，虽然温度和降水提供了环境背景，但来自饲料的直接营养输入可能在构建肠道微生物组合方面发挥更重要的作用。这一解释与其他鹿科动物的研究结果一致，那些研究也报告季节性饮食变化是影响肠道微生物组组成的主要因素。
2. 季节性能量稳态的功能性重组
我们研究的一个重要贡献在于为微生物组季节性变化的功能性后果提供了见解。从我们数据推断出的代谢通路与肠道微生物组的协调功能性重组相吻合，这可能有助于宿主在不同季节维持能量平衡。
在营养匮乏的冬季，肠道微生物组似乎重新配置其代谢机制，以优化从高纤维、低质量饲料中提取能量。这通过脂肪酸和脂质生物合成与降解、氨基酸降解以及TCA循环相关通路的显著富集得以证明，表明代谢向分解代谢和高效产能方向转变。TCA循环的上调表明从有限底物中通过细胞呼吸生成ATP的能力增强。此外，增加的脂肪酸代谢可能具有多种功能，包括为宿主产生能量丰富的短链脂肪酸以及在寒冷条件下维持微生物细胞膜。氨基酸降解通路的显著富集尤为重要；它意味着在膳食蛋白质不足时期，宿主可能依赖微生物组分解可用蛋白质并回收氮，以合成膳食中稀缺的必需氨基酸。这种在匮乏时期增强粗纤维利用和养分回收的功能转变，在野生大熊猫和长臂猿中也有观察到，表明食草动物中存在一种趋同的适应策略。
与此形成鲜明对比的是，春夏生长季节的代谢特征以快速生长和能量利用为导向。糖酵解通路的富集反映了新鲜叶片中易消化碳水化合物的可用性，有利于快速能量获取。此外，氨基酸生物合成通路，尤其是在夏季的显著富集，与宿主在丰富、高蛋白饲料时期的合成代谢状态相符。微生物组通过合成多种必需氨基酸，积极支持宿主的生长和繁殖活动。这种从冬季分解代谢、能量搜寻模式转变为夏季合成代谢、支持生长模式的功能可塑性，已在其他物种中得到充分记载，例如食用季节性农产品的人类和利用果实丰富季节的灵长类动物。秋季则是一个过渡期，微生物组为即将到来的冬季做准备，以基本氨基酸的生物合成为标志，可能旨在建立宿主储备。
值得注意的是，由于这些解释源于从序列数据推断的通路谱，它们仍是暂时的，并未提供微生物活性或宿主代谢状态的直接证据，确认需要直接的功能和宿主水平测量。
3. 对保护与野生动物管理的意义
理解饮食、微生物组和宿主适应之间的复杂相互作用对于濒危野生动物的保护至关重要。我们的研究结果强调了保护栖息地多样性的首要重要性，栖息地多样性提供了多样化且季节适宜的食物供应。鹿的恢复力与其肠道微生物组的功能可塑性密切相关，而后者又依赖于全年特定饲料植物的可得性。栖息地破碎化、土地利用变化以及气候变化引起的植物物候变化等人类活动影响，可能会破坏这种微妙的季节性平衡。此类干扰可能导致可用饲料与鹿的代谢需求不匹配，从而损害微生物组的适应能力，导致营养胁迫、体质下降和种群衰退。
这些发现对野生动物管理策略具有启示意义。在严酷冬季需要考虑补充投喂的情况下，管理者应选择能够支持而非破坏适应冬季的肠道微生物组的饲料配方。具体而言，富含易消化简单碳水化合物的饲料可能对适应高纤维饮食的微生物群有害，因此应谨慎使用或避免。
4. 局限性与未来方向
尽管本研究对梅花鹿的季节性“饮食-微生物组”关系进行了详尽考察，但承认某些局限性是重要的。首先，我们的功能分析基于从16S rRNA基因标记预测的代谢潜能。尽管这种方法具有参考价值，但它不评估实时的微生物活性。未来采用宏转录组学和宏蛋白质组学的研究对于验证这些预测的功能转变是否在基因表达和蛋白质合成中体现至关重要，正如最近的灵长类动物研究所展示的那样。其次，我们的研究与野生动物微生物组科学中的大多数研究一样，是相关性研究。尽管饮食与微生物组功能之间存在强烈的、生物学上合理的相关性，但要明确建立因果关系还需要受控实验。第三，我们的分析使用了粪便样本，这主要反映了远端肠道的群落，可能无法完全捕捉其他胃肠道区段的微生物动态。
未来研究应采用多组学方法，包括代谢组学，以直接测量肠道微生物组的代谢输出，并将其与宿主的生理状态相关联。对个体进行多年纵向监测有助于区分一致的季节性模式与个体间的变异性。此外，探索其他微生物界（如真菌和病毒）的作用，可能揭示这个动态生态系统内进一步的复杂性和调控机制。
结论
我们的研究表明，华南梅花鹿的肠道微生物组是一个响应灵敏且功能可塑的群落，适应可预测的季节性变化。观察到的微生物代谢通路转变，从资源丰富季节的合成代谢、生长导向模式，转变为营养稀缺冬季的分解代谢、节能模式，表明了微生物组在促进宿主生理适应方面的潜在作用。这些相关性发现提示，微生物组可能作为宿主与其波动环境之间的中介，潜在地影响着野生种群的健康、恢复力和生存。
