《Microorganisms》：Novel Endophytic Fungi from Euchresta tubulosa Dunn: Characterization of Their Bioactive Secondary Metabolites and Extracellular Enzymes
Xinlian Yin,
Wei Guo,
Qing Wang,
Rushuang Nie,
Dujiang Qing,
Yao Hu,
Sisi Hu,
Linxin Wang,
Xiaolin Ye and
Jiang Cheng
+ 1 author
编辑推荐：
本文首次系统揭示了濒危药用植物管萼山豆根内共生真菌的多样性、代谢潜力与生物技术价值，通过对55株内生真菌的分离鉴定，发现3个潜在新分类单元（包括1个新属），其发酵产物富含类黄酮、生物碱等活性成分，展现出显著的抗菌、抗氧化活性及蛋白酶、淀粉酶、羧甲基纤维素酶等多重水解酶生产能力，为新型天然药物先导分子发现和工业酶制剂开发提供了重要的微生物资源与理论依据。
引言
天然产物药物的发现长期依赖野生植物资源，然而随着资源枯竭等问题，寻找新的生物来源成为当代药物开发的迫切需求。内生真菌是一类在植物组织内与宿主共生而不引起明显病症的真菌，自1993年从短叶红豆杉中分离出产紫杉醇的内生真菌 Taxomyces andreanae以来，其功能角色得到广泛认知。内生真菌与植物相互作用，不仅影响宿主生长发育、修复和代谢，其自身代谢产物亦显示出抗癌、抗氧化、抑制病原菌等多种生物活性，被视为宿主基因组的延伸。
管萼山豆根（Euchresta tubulosaDunn）是豆科山豆根属植物，在土家族医药中被视为“名族药材”，其根部用于治疗胃痛、腹痛、咽喉肿痛。该植物含有生物碱、类黄酮、萜类等活性成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎特性，但因生境特殊、自交不亲和、自然结实率低而极度濒危，被列为国家Ⅱ级保护植物，其药材稀缺严重制约了活性成分与药理机制研究。目前对该植物的研究主要集中于化学成分、药理活性及临床应用，关于其内生真菌的国际报道极少。为深入挖掘其内生微生物资源、发现结构新颖的活性次生代谢物及高活性酶，本研究对管萼山豆根的内生真菌进行了分离鉴定，并对其中三株特色菌株的胞外酶及次生代谢物进行了深入研究。
材料与方法
研究材料于2023年7月13日与10月13日采集自湖南省桑植县天平山，经董爱文教授鉴定。采用组织块法从新鲜根、茎、叶中分离内生真菌，通过形态学与分子（ITS）分析进行鉴定。菌株发酵产物的化学谱通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，胞外酶（纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶）产量通过显色平板法和液体发酵评估。抗菌活性测定采用微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），抗氧化活性通过羟基自由基与ABTS自由基清除实验评价。胞外酶活性采用透明圈法初步评估，并通过液体发酵定量测定蛋白酶、淀粉酶、羧甲基纤维素酶（CMCase）活性。
结果
1. 管萼山豆根内生生真菌的分离与鉴定
从新鲜植株中共分离到55株内生真菌，初步rRNA-ITS序列分析将其归类于17个属的33个物种。优势菌属为炭疽菌属（Colletotrichum，占34.5%）、镰刀菌属（Fusarium，21.8%）和青霉属（Penicillium，9.1%）。NCBI-BLAST同源性分析显示，菌株ETG-1-2-1、ETY-2-B-b-II.1、ETXG-1-1-1与最近亲缘种的序列相似性≤97%，可能代表属或种水平的新分类单元。其中ETG-1-2-1与最近似菌株序列同源性不高于90%，被鉴定为一个新属，命名为Neocrinipellis albifloccumETG-1-2-1（保藏号CGMCC No. 41962）；ETY-2-B-b-II.1被鉴定为炭角菌属新种，命名为Xylaria cinereonitensETY-2-B-b-II.1（CGMCC No. 42144）；ETXG-1-1-1被鉴定为篮状菌属新种，命名为Talaromyces polymorphusETXG-1-1-1（CGMCC No. 41927）。
2. 选定内生生真菌的形态特征
三株内生真菌在PDA培养基上呈现不同的菌落形态与生长动态。ETG-1-2-1菌落圆形、白色、绒毛状，7天直径达7.25 cm，平均径向生长速率（9.61 ± 0.26） mm/天。ETY-2-B-b-II.1初期白色，成熟后变黑，质地薄绒状，生长缓慢，7天直径约5.58 cm。ETXG-1-1-1菌落绒毛状，中心平坦具放射状皱纹，边缘白色、中心红色，生长最慢，7天直径约3.99 cm。
3. 内生生真菌次生代谢物的LC-MS分析
对三株内生真菌发酵产物进行LC-MS分析，共检测到1424种代谢物，其中698种为三菌株共有。SuperClass分类显示，脂质及类脂分子、有机酸及其衍生物、有机杂环化合物、苯系物是除未分类代谢物外最丰富的类别。此外，鉴定出11种生物碱、18种类黄酮、26种萜类和59种类固醇。部分活性成分包括具有降压镇静作用的利血平、具有降血糖改善血脂作用的葫芦巴碱、以及具有抗炎抗纤维化抗肿瘤作用的氧化苦参碱等。值得注意的是，这些化合物在本课题组前期对管萼山豆根植物样本的LC-MS/MS分析中亦有检出，提示内生真菌次生代谢物与宿主植物活性成分存在相似性，可能与宿主生长过程存在关联。
4. 内生生真菌发酵产物的生物活性测定
抗菌活性：三株菌发酵产物的乙酸乙酯提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌均显示出不同程度的抑制活性。其中ETG-1-2-1提取物对大肠杆菌的MIC最低（2.5 mg/mL），对白色念珠菌的MIC也最低（1.25 mg/mL）。三株提取物对金黄色葡萄球菌的MIC相同，均为2.5 mg/mL。
抗氧化活性：羟基自由基清除实验显示，在4 mg/mL浓度下，ETG-1-2-1和ETY-2-B-b-II.1提取物的清除率分别达81.84%和80.10%，优于ETXG-1-1-1（74.60%）。ABTS自由基清除实验显示，在4 mg/mL浓度下，ETY-2-B-b-II.1提取物的清除率高达95.69%，显著超过阳性对照Vc，而ETG-1-2-1和ETXG-1-1-1的清除率较低，分别为52.14%和64.07%。
5. 透明圈法评估内生生真菌胞外酶活性
蛋白酶：三株菌在脱脂牛奶琼脂平板上均能产生水解圈。ETG-1-2-1和ETXG-1-1-1在培养2天后酶活性区（ZA）值持续低于0.69，显示强蛋白酶生产能力。ETY-2-B-b-II.1的ZA值随时间增加（酶活性下降）。
淀粉酶：在无机盐淀粉琼脂平板上，ETG-1-2-1在前3天ZA值低于0.69，显示强淀粉酶活性。ETY-2-B-b-II.1的菌落直径始终大于水解圈直径（ZA > 1），ETXG-1-1-1则生长微弱，酶活性低。
羧甲基纤维素酶：在CMC-Na琼脂平板上，三株菌均能产生水解圈。ETXG-1-1-1在整个生长周期中ZA值始终低于0.45，显示出持续高效的CMCase生产能力。ETG-1-2-1和ETY-2-B-b-II.1的ZA值分别在培养第3天和第2天达到最佳（最低）值。
6. 胞外酶活性定量分析
蛋白酶：在脱脂牛奶液体培养基中发酵，ETXG-1-1-1在第2天的蛋白酶活性最高，达（2.34 ± 0.14） U/mL。ETG-1-2-1和ETY-2-B-b-II.1的峰值活性分别为（1.26 ± 0.08） U/mL（第2天）和（1.04 ± 0.06） U/mL（第4天）。
淀粉酶：在无机盐淀粉液体培养基中，ETG-1-2-1在第4天的淀粉酶活性最高，达（10.95 ± 0.38） U/mL。ETXG-1-1-1和ETY-2-B-b-II.1的峰值活性分别为（9.60 ± 0.42） U/mL（第2天）和（6.89 ± 0.66） U/mL（第4天）。
羧甲基纤维素酶：在CMC-Na液体培养基中，ETG-1-2-1在第3天的CMCase活性最高，达（9.68 ± 0.30） U/mL。ETY-2-B-b-II.1和ETXG-1-1-1的峰值活性分别为（6.17 ± 0.15） U/mL（第5天）和（3.00 ± 0.06） U/mL（第4天）。
讨论
长期共进化使内生真菌与宿主植物形成协同互作，增强了宿主对生物与非生物胁迫的适应性，并形成了独特的宿主特异性内生群落。本研究从管萼山豆根不同组织分离的55株内生真菌隶属于17个属，其中炭疽菌属、镰刀菌属和青霉属为优势属。结合形态与分子鉴定，发现了一个新属和两个新种。
内生真菌是未开发真菌多样性的主要储库，能够产生大量多样的次生代谢物。本研究中三株内生真菌的代谢物分析揭示了丰富的生物碱、类黄酮等活性成分。值得注意的是，菌株ETG-1-2-1和ETXG-1-1-1能产生同样存在于宿主植物中的氧化苦参碱，该成分具有广谱药理活性。发酵产物的抗菌活性可能部分归因于此类次生代谢物的产生或调控。同时，检测到的山奈酚、樱花素、橙皮素等类黄酮也见于宿主植物，这些成分具有多种药理活性。抗氧化实验表明，发酵产物的抗氧化特性可能部分源于其次生代谢物中的类黄酮化合物。这些发现提示，管萼山豆根内生真菌可作为可持续的替代资源，缓解植物资源短缺，其生物活性代谢物在新药研发中具有重要潜力。
胞外酶自发现以来，其在致病性和底物降解中的作用被广泛研究。微生物产生的蛋白酶、淀粉酶、羧甲基纤维素酶等已广泛应用于食用菌栽培、烘焙、食品加工、生物燃料和医疗保健领域，逐渐成为工业酶制剂的主要来源。本研究胞外酶活性测定显示，三株管萼山豆根内生真菌拥有丰富的胞外酶谱。ETG-1-2-1和ETXG-1-1-1均表现出高蛋白酶生产能力。ETG-1-2-1在早期培养阶段表现出强淀粉酶生产能力，在伞菌科真菌中较为突出。三株菌均表现出较强的CMCase生产能力，其中ETXG-1-1-1在固体培养条件下能持续高效生产CMCase，其能力优于已报道的部分篮状菌属菌株。
液体发酵定量分析进一步揭示了三株菌在蛋白酶、淀粉酶和CMCase产量上的显著差异。ETG-1-2-1表现出卓越的多糖降解能力，其淀粉酶和CMCase活性均显著高于另外两株菌。ETXG-1-1-1在液体发酵中能产生高活性淀粉酶，但在固体发酵中几乎无淀粉酶活性；其CMCase在固体培养中显示出极高生产潜力，但在液体培养中活性相对较低，这主要归因于不同培养方法下菌株产酶机制的差异，与许多先前研究结果一致。这些结果进一步证实了内生真菌在生产工业酶方面的潜力。
结论
本研究首次系统报道了濒危药用植物管萼山豆根内生真菌的多样性、代谢特征及胞外酶活性。采用组织块培养法获得55株内生真菌，依据形态和分子特征归类于17个属，其中炭疽菌属、镰刀菌属和青霉属为优势属，并发现包括三个新分类单元在内的四个潜在新物种。对三株潜在新物种发酵产物的代谢物分析揭示了丰富的药用相关生物活性化合物，如类黄酮和生物碱。结合生物活性测定，三株菌的发酵产物均表现出不同程度的抗菌和抗氧化活性。胞外酶活性测定表明，部分菌株具有广谱底物水解能力。值得注意的是，菌株ETG-1-2-1表现出卓越的多糖降解能力，显示出最高的淀粉酶和纤维素酶活性（分别为10.95 U/mL和9.68 U/mL）；而菌株ETXG-1-1-1则显示出突出的蛋白酶活性（2.34 U/mL），并在固体发酵条件下长期保持强CMCase生产能力。这些发现为未来从内生真菌中探索生物活性天然产物、开发酶制剂及利用微生物资源奠定了基础。
