《Microorganisms》：Nuclear Localization of Effector BPE159: A Pivotal Mechanism for Intracellular Persistence of Brucella by Hampering Host Autophagy
Yidan Zhang,
Tingting Lyu,
Shengnan Song,
Yu Zhang,
Chunyan Wei,
Liangbo Liu,
Zhen Wang,
Zhihua Sun,
Xia Zhou and
Hui Zhang
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本研究首次揭示了布鲁氏菌候选效应蛋白BPE159定位于宿主细胞核，通过与宿主蛋白Eci1相互作用，下调自噬相关因子表达，从而抑制宿主自噬，是布鲁氏菌实现胞内持久感染的关键新机制。研究明确了BPE159在菌体生存中的重要作用，为深入理解布鲁氏菌病(T4SS)的致病机理及开发新型干预策略提供了重要靶点。
布鲁氏菌是一种被忽视的食源性病原体，可污染受感染动物的乳汁、乳制品、肉类及肉制品。然而，依赖IV型分泌系统（T4SS）发挥作用的布鲁氏菌候选效应蛋白（BPE）家族的功能尚不完全清楚。本研究旨在探讨BPE159在调控宿主细胞自噬中的作用机制。
BPE159定位于宿主细胞核并发挥调控功能
为明确BPE159蛋白的亚细胞定位，研究人员将pDsRed 2-C1-BPE159质粒转染至HEK293T细胞，并通过激光共聚焦显微镜进行观察。结果显示，BPE159主要定位于宿主细胞的细胞核内，而转染空载体pDsRed 2-C1的对照组中则未检测到BPE159信号。进一步的生物信息学分析表明，BPE159不含有信号肽切割位点或跨膜结构，但具有核定位信号。这些发现共同证实，BPE159在亚细胞水平上定位于细胞核，并在宿主细胞核内进行翻译，提示其可能通过进入细胞核来调控宿主基因表达等生物学过程。
筛选与验证BPE159相互作用的宿主蛋白
为了寻找与BPE159相互作用的宿主蛋白，研究采用了酵母双杂交技术对RAW264.7细胞的cDNA文库进行筛选。首先验证了BPE159蛋白在酵母系统中无自激活活性和毒性。随后，将诱饵质粒pGBKT7-BPE159与cDNA文库共转化酵母细胞，经过选择性培养基筛选和测序分析，初步鉴定出三个可能与BPE159相互作用的蛋白：Eif3g、Mrpl19和Eci1。后续的共转化验证实验确认了这三个蛋白在酵母系统中均能与BPE159发生相互作用。
为了在哺乳动物细胞中验证这些相互作用的真实性，研究进行了免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）实验。将pCMV-HA-BPE159与分别携带GFP标签的Eif3g、Mrpl19、Eci1的质粒共转染至HEK293T细胞。Western blot分析结果显示，在免疫沉淀产物中仅能检测到Eci1蛋白，表明在HEK293T细胞中，BPE159特异性地与宿主蛋白Eci1发生相互作用。激光共聚焦显微镜观察进一步证实，BPE159与Eci1在宿主细胞核内存在共定位。此外，分子对接模拟也支持BPE159与Eci1之间存在直接的相互作用界面。
Eci1的基因本体论与通路分析
为了深入理解Eci1的生物学功能，研究对其进行了基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析。GO分析显示，Eci1主要定位于线粒体和细胞内细胞器，具有催化活性和氧化还原酶活性，并参与核苷酸序列连接等生物过程。KEGG通路分析表明，Eci1主要参与脂肪酸代谢、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸的降解以及过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路等细胞代谢过程。蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络预测分析还发现，Eci1可能与MRPL58、FBXL19等蛋白存在潜在相互作用。
BPE159通过调控Eci1抑制自噬并促进布鲁氏菌胞内存活
接下来，研究探讨了BPE159是否影响Eci1的表达及其在布鲁氏菌感染过程中的功能。通过构建布鲁氏菌流产杆菌（Brucella abortus）S2308的BPE159基因缺失株（ΔBPE159）及其回补株（ΔBPE159-C），研究团队在巨噬细胞RAW264.7中进行了感染实验。
实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示，与感染野生型菌株相比，感染ΔBPE159菌株的巨噬细胞内Eci1的mRNA表达水平显著降低。这种表达下调在感染后4至24小时内均持续存在，表明BPE159能增强宿主细胞内Eci1的转录，且这种增强作用不依赖于感染时间。
胞内存活实验表明，ΔBPE159菌株在RAW264.7细胞内的存活能力显著低于野生型菌株和回补株，而回补株的存活能力则恢复至与野生型相当的水平。这证明BPE159的缺失损害了布鲁氏菌在宿主细胞内的生存，提示BPE159是布鲁氏菌的一个重要毒力因子。
为了探究BPE159影响菌体生存的机制，研究检测了自噬相关基因的表达和蛋白水平。qRT-PCR分析发现，与感染野生型菌株相比，感染ΔBPE159菌株的巨噬细胞中，自噬相关基因ATG16L1、BECN1、ATG4和LC3的mRNA表达水平均显著上调。Western blot实验进一步证实，在感染24小时后，无论是正常条件还是使用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（Baf-A1）处理的条件下，ΔBPE159菌株感染组中自噬标志蛋白p62的水平降低，而LC3B-II/LC3B-I的比值升高，表明细胞自噬水平增强。这些结果综合表明，BPE159蛋白能够通过抑制宿主细胞的自噬，从而促进布鲁氏菌在细胞内的存活。
结论与讨论
本研究发现，布鲁氏菌效应蛋白BPE159能够定位至宿主细胞核，并与宿主蛋白Eci1发生特异性相互作用。BPE159通过上调Eci1的表达，进而下调包括ATG16L1、BECN1、ATG4和LC3在内的关键自噬因子的表达，最终抑制了宿主细胞的自噬流。这种对宿主自噬的抑制，为布鲁氏菌在细胞内营造了一个利于其生存和复制的微环境，是其实现持久感染的新机制。
Eci1是线粒体脂肪酸β-氧化过程中的关键酶。本研究首次将Eci1与细菌感染及自噬调控联系起来，揭示了BPE159-Eci1轴在布鲁氏菌致病过程中的重要作用。这一发现不仅拓宽了对布鲁氏菌T4SS效应蛋白功能的认识，也为针对布鲁氏菌病开发以宿主因子为靶点的新型抗菌策略提供了新的理论依据和潜在干预靶点。当然，关于BPE159如何精确调控Eci1的转录、以及Eci1影响自噬的具体下游信号通路等分子细节，仍有待进一步深入探索。
