《Microorganisms》：Effect of Dryland-to-Paddy Conversion on Soil Aggregate Phosphorus Fractions and Microbial Functional Diversity in a Typical Black Soil Region of the Sanjiang Plain
Bo Bo,
Xinghong Liu,
Zijian Xie,
Chunhua Li,
Yang Wang and
Chun Ye
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本文研究了在东北三江平原黑土区旱田转变为水田后，土壤基本性质、团聚体稳定性、磷（P）组分分布及微生物群落结构的变化。结果表明，土地利用方式改变后，土壤电导率（EC）和有机碳（SOC）显著增加，促进了大团聚体和微团聚体的形成。土壤全磷（TP）增加了16.04%，其主要（83.81%）由大团聚体贡献。优势磷组分由NaOH-Po（中等活性有机磷）向NaOH-Pi（中等活性无机磷）和HCl-Pi（低活性无机磷）转化。同时，水田土壤中与磷循环相关的功能微生物（如慢生根瘤菌属和假单胞菌属）丰度及功能基因（如 gcd、phoD 和 phnA）表达发生显著变化。研究揭示了旱改水后土壤性质-团聚体磷-微生物功能的联动机制，为黑土区磷素管理与可持续农业提供科学依据。
引言
土壤磷是植物生长发育的必需营养元素，在土壤养分循环中起着关键作用。土壤团聚体作为土壤结构的基本单元，是土壤有机质分解和转化的主要场所，并通过物理保护（尤其是在微团聚体内）调控非生物有效性磷的储存。研究土壤团聚体与磷的相关性，对于理解微观尺度上的土壤磷循环至关重要。Hedley顺序提取法可用于评估土壤基质中磷的结合强度，所获得的磷组分通常分为三类：高活性磷、中等活性磷和低活性磷。微生物是土壤磷循环的关键驱动者，解磷微生物（PSMs）通过促进无机磷的解吸或有机磷的分解来增强土壤磷的有效性。
兴凯湖位于黑龙江省东南部中俄边境，是东北亚最大的国际界湖。该区域以黑土为主，是三江平原的核心产粮区。近年来，兴凯湖流域农田面积持续增加，水田面积显著扩大，主要由旱田转化而来。从旱田到水田的土地利用转换涉及将低洼、易涝、低产的旱田改造成高产水田，从而提高了土壤生产力。这种转变会改变土壤水分含量、氧化还原电位、pH值、有机质和微生物群落结构，进而影响土壤磷的转化。因此，研究旱改水过程中磷组分和微生物群落的变化，对于理解驱动土壤磷循环的机制具有重要意义。
材料与方法
1. 研究区域
研究区域位于黑龙江省鸡西市，主要为平原。根据K?ppen-Geiger气候分类系统，该地区属于Dwc型，即冬季干燥、夏季湿润的亚寒带气候。年降水量为559毫米，约70%的降雨集中在6月至9月。该地区的土地利用发生了显著变化。从1990年到2020年，兴凯湖流域的水田面积增加了近688平方公里，其中520平方公里由旱田转化而来，约占水田总面积的30%。
2. 样品采集与处理
采样区域包括旱田和水田样点，位于三江平原兴凯湖流域的农业区内。土壤样本于2024年11月收获季节后采集。共设置了24个采样点，包括9个旱田样点和15个水田样点。从旱田到水田的土地利用转换发生在五年多以前。所有采样点都位于兴凯湖沿岸地区，具有相似的地质背景条件。在每个采样点，采集三份样品并混合形成一个复合样品。使用土钻采集表层（0-20厘米）土壤。采集前小心去除地表凋落物。每个复合样品被分成三部分，立即储存在便携式冰箱中，并迅速运至实验室。第一部分用于微生物学检测。剩余样品经风干至恒重后，第二部分过2毫米（10目）、0.25毫米（60目）和0.15毫米（100目）筛，用于分析基本理化性质。第三部分样品采用湿筛法分离为三种团聚体组分：粉粒+黏粒（<0.053毫米）、微团聚体（0.053~0.25毫米）和大团聚体（0.25~2毫米）。
3. 基本土壤性质测定
土壤pH和电导率（EC）使用pH计和EC计按土水比1:2.5测定。土壤有机碳（SOC）采用重铬酸钾消解法测定。全氮（TN）采用凯氏定氮法测定。全磷（TP）用HNO3-HF微波消解，并通过ICP-OES分析。土壤团聚体粒径分布使用激光衍射粒度分析仪进行分析。
4. 土壤磷组分分析
土壤磷组分采用Hedley顺序提取法获得。该程序分离出九种磷组分：H2O-Pi、NaHCO3-Pi、NaHCO3-Po、NaOH-Pi、NaOH-Po、HCl-Pi、conc.HCl-Pi、conc.HCl-Po和Residual-P。各提取液中的无机磷（Pi）含量采用钼蓝比色法测定。滤液中的总磷（Pt）在用过HClO4和H2O2溶液消解后，用钼蓝比色法测定。有机磷（Po）计算为总磷与无机磷之差（Po = Pt - Pi）。
5. 土壤微生物高通量测序与生物信息学分析
宏基因组测序及后续分析由深圳微科盟科技集团有限公司完成。每个样本分析了三个独立的生物学重复。使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法从0.25克土壤中提取基因组DNA。使用NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit构建测序文库。在Illumina NovaSeq Xplus测序平台上进行测序。使用Trimmomatic处理原始读数，并利用Bowtie2去除宿主DNA序列。使用Kraken2对比包含NCBI NT和RefSeq数据库中细菌、真菌、古菌和病毒序列的自定义数据库进行物种分类分析。通过HUMAnN3将高质量读数与UniRef90蛋白质数据库比对，鉴定与磷代谢和循环相关的基因，随后针对KEGG同源物数据库进行功能注释。
6. 数据分析
利用微科盟Bioincloud平台提取和分析微生物丰度及功能基因，并基于单因素方差分析生成聚类热图。使用OriginPro 2022 V9可视化磷组分组成，创建解磷功能基因条形图，并展示PSMs丰度。使用RStudio 9.5.191.52，通过PLS-PM路径模型构建结构方程模型（SEM），分析土壤性质、磷循环功能微生物、功能基因丰度与团聚体磷含量之间的关系。
结果
1. 土地利用变化对基本土壤性质的影响
研究区域土壤呈中度酸性。从旱田转为水田后，土壤电导率（EC）和有机碳（SOC）显著增加（p < 0.05），而pH、TN和TP呈上升趋势。此外，水田中微团聚体和大团聚体的比例显著高于旱田（p < 0.05）。相反，旱田中粉粒+黏粒组分的比例显著高于水田（p < 0.05）。转换后团聚体的稳定性趋于增加。该土壤被归类为TP含量丰富和较丰富的水平，表土表现出明显的磷累积、独特的磷组分、高度集中的剖面分布模式以及一定的相关环境风险。与旱田相比，水田土壤全磷增加了16.04%。在旱田中，主要的磷组分是NaOH-Pi、NaOH-Po和Residual-P，分别占23.98–26.12%、16.47–27.03%和25.71–30.66%。在水田中，主要成分是NaOH-Pi、HCl-Pi和Residual-P，分别占33.07–41.89%、11.84–18.32%和20.35–23.92%。旱田改水田后，磷组分构成从以NaOH-Po为主转变为以NaOH-Pi和HCl-Pi为主。具体而言，NaOH-Pi增加了8.76–17.91%，HCl-Pi增加了5.69–10.32%，而NaOH-Po减少了8.85–16.09%。
大团聚体的磷含量最高。旱田改水田后，NaOH-Pi在水田中表现出最高值（粉粒+黏粒组分中为330.9毫克/千克，微团聚体中为381.9毫克/千克，大团聚体中为869.1毫克/千克），其次是Residual-P（粉粒+黏粒、微团聚体和大团聚体中分别为239.3、209.3和429.3毫克/千克）。相比之下，H2O-Pi和conc. HCl-Po的含量相对较低。总体而言，旱田改水田对中等活性磷（NaOH-Pi、NaOH-Po和HCl-Pi）的影响最为显著。除了粉粒+黏粒组分中的NaOH-Pi，这三种磷组分在旱田和水田之间的差异在团聚体类型中均显著（p < 0.05）。
2. 土地利用变化对土壤磷循环功能微生物的影响
细菌和真菌是研究区域土壤微生物的主要组成部分。在与磷循环相关的前20个属中，有19个是细菌，1个是真菌。细菌在土壤微生物中表现出最高的相对丰度（58.32%）。在门水平上，假单胞菌门、放线菌门和芽孢杆菌门是最具代表性的门，分别鉴定出11、4和3个物种。在属水平上，慢生根瘤菌属、假单胞菌属、中慢生根瘤菌属、链霉菌属和节杆菌属表现出最高的相对丰度，在旱田和水田中分别占20.3%和21.5%。从旱田转为水田后，土壤微生物α多样性略有变化，但无统计学意义（p > 0.05），而微生物β多样性则观察到显著差异（p < 0.05）。具体而言，链霉菌属、中慢生根瘤属、类芽孢杆菌属和镰刀菌属的相对丰度分别显著下降了2.04%、2.87%、0.22%和0.04%，而黄杆菌属和微杆菌属的相对丰度分别显著增加了0.06%和0.43%（p < 0.05）。此外，慢生根瘤菌属、假单胞菌属和节杆菌属的相对丰度分别增加了3.90%、1.45%和0.79%，而小单孢菌属的丰度下降了0.55%（p > 0.05）。其中，慢生根瘤菌属的变化最大，从8.86%增加到12.77%。LEfSe分析进一步揭示了旱田和水田之间的差异类群。在解磷微生物中，中慢生根瘤菌属和链霉菌属被鉴定为旱田的特征类群，而慢生根瘤菌属、节杆菌属和微杆菌属被鉴定为水田的特征类群。
3. 土地利用变化对参与土壤磷循环功能基因的影响
对于旱田和水田，有机磷矿化基因的相对丰度分别为0.18%和0.17%，而无机磷溶解基因的相对丰度分别为0.28%和0.24%。关于有机磷矿化基因，phnA、phoD、glpK和glpA显示出相对较高的丰度。对于无机磷溶解基因，pqqC、ppx、ppa、ppk和gcd具有相对较高的丰度。此外，phnA、pqqE、pqqC和ppx基因的相对丰度显著增加，而phnP、phoD和gcd基因的相对丰度显著降低，表明这些基因可能在旱田改水田过程中的土壤磷循环中起关键作用（p < 0.05）。
旱田改水田后，参与土壤磷循环的关键功能基因类型未发生变化，但其丰度发生了明显变化。具体而言，与无机磷溶解相关的基因（如pqqE、pqqC和gcd）的相对丰度显著降低，而ppx的相对丰度显著增加（p < 0.05）。此外，在与有机磷矿化相关的基因中，phnA的丰度显著增加，而phnP和phoD的丰度显著降低（p < 0.05）。与其它基因约0.01%的变化相比，gcd、phoD和phnA的变化尤为显著，变化了约0.03%。
讨论
1. 旱田改水田过程中土壤基本性质的变化：对磷组分和微生物群落结构的双重影响
根据SEM结果，在土壤性质、参与磷循环的微生物和基因的相对丰度以及不同团聚体中的磷组分之间发现了显著的因果关系。该模型与数据拟合良好，拟合优度（GOF）值为0.492，并有效地说明了变量之间的直接和间接路径。在该模型中，土壤性质对基因的相对丰度产生了显著的负面影响（-0.768），而基因的相对丰度对粉粒+黏粒组分的磷含量表现出显著的正效应（0.797）。这些结果表明，基本土壤性质的变化显著改变了与解磷相关的功能基因的表达，进而强烈影响了粉粒+黏粒组分中磷动态的平衡。基因的相对丰度对微生物的相对丰度具有显著的正效应（0.532），表明功能基因的表达水平是相应微生物群落结构的关键驱动因素。
总之，微生物组成和功能基因丰度在土壤磷循环中起着至关重要的作用。土壤性质的变化通过对磷组分和微生物群落结构的双重影响驱动磷的转化。
旱田改水田的土地利用转换后，土壤从有氧环境转变为长期或间歇性厌氧状态，导致氧化还原电位急剧下降。高价Fe/Mn氧化物的还原消耗H+，导致pH值略微升高（0.08个单位），使土壤趋向于酸性减弱。由于土壤的缓冲能力，pH值在狭窄范围内波动。此外，稻草还田与厌氧环境相结合，减缓了有机质的分解，显著提高了SOC含量。而且，由于施肥、灌溉和蒸发的改变，土壤中碱基离子浓度增加，导致EC显著上升。
旱田改水田过程中磷形态的变化与土壤理化性质密切相关。pH影响磷酸盐的沉淀和溶解平衡，而EC影响其吸附和解吸行为。在酸性土壤中，pH降低促进Fe3+和Al3+固定磷，形成铁/铝氧化物沉淀，而pH升高则增强了磷的有效性。EC升高增加了可溶性盐（如SO42-、Cl-、Ca2+、K+）的浓度，这些离子与磷酸盐竞争土壤颗粒上的吸附位点，促进固定磷的解吸。土壤溶液中的高离子强度可以压缩土壤胶体周围的扩散双电层。这种压缩降低了胶体表面的静电势，从而削弱了磷酸根离子在可变电荷矿物和黏粒颗粒边缘的特异性和非特异性吸附。因此，更多的磷酸根离子被释放到土壤溶液中，增加了生物有效磷。此外，有机质分解产物可与金属离子形成络合物，并与磷酸盐竞争土壤胶体上的吸附位点，进一步减少磷的固定。
本研究中，EC与NaOH-Pi和HCl-Pi呈显著正相关（p < 0.05）。相反，EC与高活性磷呈负相关，并且在粉粒+黏粒组分中关系显著（p < 0.05）。这些发现表明，在旱田改水田过程中，EC在磷组分从高活性磷向中等活性和低活性磷的转化中起着至关重要的作用。SOC的增加促进了微团聚体和大团聚体的形成，两者分别增加了130%和355%。这些团聚体对磷起到物理保护作用，减少了其流失。SOC与HCl-Pi呈显著正相关，表明其在低活性磷的形成中起核心作用（p < 0.05）。本研究证实，旱田改水田后，TP增加了16.04%，主要归因于大团聚体（83.81%），而粉粒+黏粒和微团聚体中的磷分别仅贡献了11.08%和5.11%。此外，无机磷肥的施用显著增加了H2O-Pi、NaOH-Pi、Residual-P和NaHCO3-Pi，并略微增加了HCl-Pi，但对有机磷组分的影响有限。这解释了本研究中低活性的HCl-Pi（64.68%）和中等活性的NaOH-Pi（89.84%）显著增加的原因。
旱田改水田改变了磷循环微生物的结构和丰度，影响了关键功能基因的表达。转换后，EC和SOC均显著增加（p < 0.05）。EC作为土壤盐分的核心指标，通过调节土壤微生物呼吸和酶活性来影响微生物量，促进微生物群落的演替。磷循环微生物参与并介导诸如分泌有机酸和磷酸酶等能量依赖过程。SOC的增加提供了碳源和能源，显著增强了微生物代谢活性并改变了群落结构。相关性热图显示，节杆菌属、微杆菌属、黄杆菌属、红假单胞菌属和沙门氏菌属与EC和SOC呈显著正相关，而链霉菌属、中慢生根瘤菌属和类芽孢杆菌属与EC和SOC呈显著负相关（p < 0.05）。因此，旱田改水田引起的土壤性质变化，在营造有利于磷循环微生物的环境方面起着至关重要的作用。
2. 土壤磷循环功能基因和微生物相对丰度的变化主导了磷组分的转化过程
解磷微生物（PSMs）通过溶解无机磷和矿化有机磷来驱动土壤磷循环。PSMs通过分泌有机酸来溶解无机磷酸盐，这些有机酸会降低土壤pH并螯合Fe3+和Al3+离子，从而释放被固定的磷，提高磷的有效性。此外，PSMs能够催化有机磷化合物（如植酸、磷脂和核酸）矿化为植物可利用的无机磷酸盐，通过酶催化、环境适应和微生物相互作用缓解磷限制。
从旱田到水田的转变引发了微生物群落的明显变化，其特征是链霉菌属、中慢生根瘤菌属、类芽孢杆菌属和镰刀菌属的显著减少，以及黄杆菌属和微杆菌属的显著增加（p < 0.05）。相关性热图显示，慢生根瘤菌属与微团聚体中的NaOH-Po呈显著负相关；假单胞菌属与黏粒+粉粒组分中的NaOH-Po呈显著正相关，与微团聚体中的NaOH-Pi呈负相关；链霉菌属与所有团聚体中的NaOH-Po均呈显著正相关，与HCl-Pi和NaOH-Pi呈负相关；中慢生根瘤菌属与微团聚体中的NaOH-Po呈显著正相关，与所有团聚体中的HCl-Pi呈负相关（p < 0.05）。此外，中慢生根瘤菌属、链霉菌属、类芽孢杆菌属和镰刀菌属显示出协同相互作用，微杆菌属、慢生根瘤菌属、节杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属之间也存在协同作用。
研究证实，慢生根瘤菌属、假单胞菌属和中慢生根瘤菌属兼具固氮和解磷能力。在高氮条件下，这些细菌可能优先利用环境中可利用的氮，从而抑制固氮基因的表达，并将能量分配重新分配给磷代谢。旱田改水田后，SOC、TN和TP的同时增加可能导致慢生根瘤菌属增强磷代谢，减少低活性磷的积累，而假单胞菌属和中慢生根瘤菌属削弱磷代谢，从而促进低活性磷的积累。此外，链霉菌属可以产生各种胞外酶来分解顽固的有机残留物，释放氮和磷。在有机质分解过程中释放的磷酸根离子容易与Ca、Fe和Al等金属离子结合，从而影响土壤中中等活性磷的动态。旱田改水田后，慢生根瘤菌属和假单胞菌属的丰度明显增加，而链霉菌属和中慢生根瘤菌属的丰度显著降低。微生物群落的这些组成变化主要驱动了粉粒+黏粒组分和大团聚体中中等和低活性磷的增加，以及微团聚体中这些磷的减少。
虽然旱田改水田的转变并未改变参与土壤磷循环的关键功能基因类型，但它显著重塑了其丰度谱，其中调控无机磷溶解和有机磷矿化的基因表现出明显且显著的变化。gcd和phoD与所有三种团聚体中的NaOH-Po呈显著正相关，与NaOH-Pi和HCl-Pi呈负相关（p < 0.05）。相反，phnA与NaOH-Pi和HCl-Pi呈显著正相关，但与NaOH-Po呈负相关（p < 0.05）。此外，phnA和ppx表现出协同相互作用，pqqE、pqqC、gcd、phnP和phoD之间也存在协同作用。
总之，土地利用转换后影响中等活性磷转化的关键基因是gcd、pqqC、pqqE、phnP、phoD、ppx和phnA。gcd、pqqC、pqqE、phnP和phoD丰度的降低，加上ppx和phnA丰度的增加，导致微团聚体和大团聚体中中等活性磷的减少，而在粉粒+黏粒组分中，其影响主要表现为无机磷的减少。这些关键基因丰度的变化影响了土壤磷循环微生物群落，并驱动了土壤磷组分的转化。
结论
本研究探讨了在典型黑土区，旱田改水田对土壤团聚体磷组分和微生物功能多样性的影响。结果表明，在从旱田到水田的转换过程中，微团聚体和大团聚体的比例显著增加。大团聚体-磷的增加贡献了全磷增加的83.81%。在转换过程中，优势磷组分从NaOH-Po转变为NaOH-Pi和HCl-Pi。假单胞菌属和慢生根瘤菌属的增加，以及链霉菌属和中慢生根瘤菌属的减少，共同驱动了磷组分的转化。调控磷转化的关键功能基因是gcd、phoD和phnA。这些发现表明，旱田改水田后土壤基本性质的改变是根本驱动因素，它影响着团聚体磷组分，进而塑造了微生物群落结构和磷循环关键功能基因的丰度。然而，本研究未能捕捉磷形态和微生物群落结构在不同土地利用转换阶段的时空动态。未来研究应探索旱田改水田过程中磷组分、微生物群落和功能基因的动态，以更好地阐明磷转化的演化机制。本研究为评估旱田改水田后的磷管理策略提供了重要参考。
