荔枝赤霉素代谢调控新突破：LcGA2ox基因家族全基因组鉴定及其在花性分化中的功能解析

《Plants》：Genome-Wide Identification of the LcGA2ox Gene Family in Litchi (Litchi chinensis Sonn.) and Its Functional Analysis in Gibberellin Metabolism and Reproductive Development Weinan Song, Fuchu Hu, Zhe Chen, Tingting Yan, Yukun He, Hongna Zhang and Boxing Shang

本研究在荔枝中鉴定出9个LcGA2ox基因，揭示了其在赤霉素(GA)代谢与生殖发育中的关键作用。通过生物信息学与功能分析，发现LcGA2ox6/7是调控荔枝花性分化的核心因子，并与雌花关键基因AGL1/SPT呈负相关，为通过分子育种调控荔枝开花与坐果提供了重要理论依据。

　　

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)赤霉素2-氧化酶(GA2ox)基因家族的全基因组鉴定及其在赤霉素代谢与生殖发育中的功能分析

赤霉素(GAs)是调控植物开花及花器官发育至关重要的植物激素。植物体内GAs的稳态由多种酶协同调控，其中赤霉素2-氧化酶(Gibberellin 2-oxidase, GA2ox)作为活性GA分解代谢的关键酶，与生物合成的限速酶GA20ox和GA3ox共同调节植物的GA平衡。GA2ox通过介导GA的2β-羟基化，将活性GA₄和GA₁分别转化为其无活性代谢物GA₃₄和GA₈，或将前体GA₉和GA₂₀转化为无活性的GA₅₁和GA₂₉。根据底物偏好性，GA2ox蛋白可分为作用于C₂₀-GAs的C₂₀-GA2ox和作用于C₁₉-GAs的C₁₉-GA2ox，后者在系统发育上可进一步分为两个亚组。在荔枝生产中，开花不稳定和雌雄花比例失衡是制约产量提升的关键因素。研究表明，外源施用烯效唑可通过降低内源GA水平来影响开花，凸显了GA在荔枝花性分化调控中的核心作用。然而，GA相关基因如何影响荔枝的开花过程及生殖器官发育，尚缺乏深入研究。

1. 荔枝LcGA2ox基因家族的鉴定与特征分析

本研究综合利用BLASTp搜索和隐马尔可夫模型(HMM)分析方法，在荔枝基因组中成功鉴定出9个LcGA2ox基因家族成员，根据其染色体位置命名为LcGA2ox1至LcGA2ox9。这些基因分布在6条染色体上（Chr1, Chr2, Chr3, Chr9, Chr13, Chr14）。LcGA2ox蛋白的氨基酸长度在332至371个残基之间，预测分子量介于37.4至41.0 kDa，理论等电点(pI)范围为6.07至9.00。亚细胞定位预测显示，家族成员的潜在定位位点主要位于细胞核、细胞质和叶绿体中。其中，LcGA2ox2和LcGA2ox3主要定位于细胞核，LcGA2ox1, LcGA2ox5, LcGA2ox8和LcGA2ox9主要分布在细胞质，而LcGA2ox4, LcGA2ox6和LcGA2ox7则主要定位于叶绿体。

2. LcGA2oxs的系统发育分类：C₁₉-GA2ox-I、C₁₉-GA2ox-II和C₂₀-GA2ox-I亚组

通过构建包含荔枝、拟南芥和水稻GA2ox蛋白的系统发育树，分析将LcGA2ox家族成员分为三个明确的组：C₁₉-GA2ox-I、C₁₉-GA2ox-II和C₂₀-GA2ox-I。具体而言，LcGA2ox4/6/7属于C₁₉-GA2ox-I亚组；LcGA2ox1/2/3/5/9属于C₁₉-GA2ox-II亚组；而LcGA2ox8则与C₂₀-GA2ox-I亚组相关联。这表明LcGA2ox1/2/3/4/5/6/7/9可能对C₁₉-GAs具有活性，而LcGA2ox8则预测对C₂₀-GAs具有活性。

3. 荔枝LcGA2ox基因家族的基因结构、保守结构域与保守基序分析

对基因结构、保守结构域和基序的系统性分析揭示了LcGA2ox蛋白间的共性与差异。所有9个荔枝GA2ox家族成员均包含2OG-Fe(II)Oxy和DIOX_N两个保守结构域。基序分析共鉴定出10个基序（基序1-10）。其中，基序9仅存在于LcGA2ox2/3中，基序6仅存在于LcGA2ox4/6/7/8中，基序4仅存在于LcGA2ox1/2/3/5/9中，表明基序4与C₁₉-GA2ox-II亚组密切相关。基序1, 3, 7, 10与2OG-Fe(II)Oxy结构域相关，而DIOX_N结构域的保守基序在不同成员间存在变异，这可能直接关系到DIOX_N结构域在底物识别中的功能特异性。基因结构分析显示，除LcGA2ox5/9含有4个内含子、LcGA2ox2/3含有5个内含子外，其余成员均只含有2个内含子，体现了该家族在进化过程中的结构多样性。

4. LcGA2ox基因的基因组分布与进化关系

共线性分析揭示了荔枝LcGA2ox基因家族的进化机制。在荔枝基因组内，LcGA2ox2和LcGA2ox9之间存在串联重复事件，表明该事件可能在GA2ox基因家族的扩张中发挥了作用。进一步的跨物种比较共线性分析（涉及荔枝、拟南芥、水稻以及龙眼、红毛丹、无患子、文冠果、假色槭等五种无患子科植物）表明，LcGA2ox2和LcGA2ox4与除水稻外的六个物种的GA2ox基因存在共线性；LcGA2ox6与五种无患子科物种的GA2ox基因共线性；LcGA2ox7与除拟南芥外所有物种的GA2ox基因共线性；LcGA2ox9与除无患子外所有物种的GA2ox基因共线性。这些结果表明这些LcGA2ox基因具有古老的进化起源，在进化史上可能保留了相对保守的功能。

5. 荔枝LcGA2ox基因启动子区域顺式作用元件分析

对LcGA2ox基因ATG起始密码子上游2000 bp的启动子区域进行分析，鉴定出16种与光响应、激素信号、胁迫适应和发育控制等生物过程相关的顺式作用调控元件。在光响应类别中，Box 4元件出现频率最高（42次）。在激素调控方面，响应脱落酸(ABA)的ABRE元件最为丰富（21次）。同时鉴定出12个拷贝的茉莉酸甲酯(MeJA)响应元件（CGTCA和TGACG）。在胁迫相关元件中，参与厌氧响应的ARE序列最为突出（19次）。在发育调控元件中，与分生组织活性相关的CAT-box基序出现频率最高（6次）。值得注意的是，除LcGA2ox3外，所有GA2ox基因都含有MeJA响应元件；除LcGA2ox4外，所有基因都含有ABA响应元件；除LcGA2ox2/5外，所有基因都含有GA响应元件。这些发现表明，荔枝中的GA2ox基因可能通过光感知、多种植物激素信号级联、环境适应机制和形态发生过程参与一系列生理过程的调控。

6. 荔枝LcGA2ox蛋白-蛋白互作预测分析

以拟南芥为参考，通过STRING数据库预测了LcGA2ox的蛋白-蛋白互作网络。预测结果显示，所有成员都可能与GA合成酶GA3ox家族互作；除LcGA2ox8外，所有成员都可能与GA合成酶GA20ox家族互作。LcGA2ox4被预测与GA信号受体GID1B互作。LcGA2ox5被预测与GA信号抑制子RGL2以及胁迫响应因子DREB1E/F形成潜在的互作网络。LcGA2ox1/2/3/9被预测与GA生物合成核心酶KAO2互作。LcGA2ox6/7被预测与GA信号抑制子RGA建立潜在的互作网络。LcGA2ox8被预测与GA信号抑制子RGL2、GAI、RGA，以及GA受体GID1B和GA生物合成途径初始步骤的关键调控酶KO互作。GAs的代谢平衡是通过合成酶和失活酶GA2ox的协调调控实现的，该互作网络阐明了GA2ox家族在荔枝GA代谢和信号通路中的核心作用。

7. 荔枝LcGA2ox基因的表达模式分析

利用‘妃子笑’荔枝的RNA-seq数据进行转录组分析，揭示了LcGA2ox基因家族成员在组织特异性表达和不同发育阶段的动态变化。

7.1. 不同荔枝组织中LcGA2ox基因表达的对比分析

在愈伤组织、根、叶、花序、果实和芽六种不同器官中，家族成员表现出明显的组织特异性表达模式。具体而言，LcGA2ox2和LcGA2ox3主要在叶片中表达；LcGA2ox1、LcGA2ox6和LcGA2ox7在花中显著表达；LcGA2ox8在果实中高表达；LcGA2ox9则在芽中 predominant 表达。这暗示了LcGA2ox成员在特定荔枝组织生长发育中具有功能分化。

7.2. 不同荔枝果实器官中LcGA2ox家族成员的差异表达

在果梗、假种皮、种子和果皮中的表达模式分析显示，LcGA2ox4和LcGA2ox8在果梗、假种皮和种子中高表达，而LcGA2ox4、LcGA2ox5和LcGA2ox8在果皮中高表达。这表明LcGA2ox4和LcGA2ox8参与赤霉素介导的果实发育，而LcGA2ox5则参与果皮特异的生理过程。

7.3. 荔枝叶芽四个发育阶段中LcGA2oxs的表达模式

在‘妃子笑’荔枝叶芽的四个发育阶段中，LcGA2ox8在所有四个阶段均表现出显著表达，其表达水平在第一、第三和第四阶段明显超过其他家族成员。相比之下，LcGA2ox4的显著表达仅在第二阶段检测到，LcGA2ox5仅在初始阶段高表达，而LcGA2ox9在随后的两个阶段表现出显著表达。这表明LcGA2ox8参与叶芽整个发育过程中GA代谢的调控，在形态发生和生长分化中起关键作用，而LcGA2ox4、LcGA2ox5和LcGA2ox9则在叶芽发育的不同关键时期发挥作用，共同促进叶芽发育的有序进行。

7.4. 荔枝果皮着色过程中LcGA2oxs的表达模式

在‘妃子笑’荔枝果皮着色（绿、黄、红）的三个阶段中，LcGA2ox4和LcGA2ox8在成熟至红色着色阶段的果皮外层表现出较高的转录活性，而LcGA2ox5仅在未成熟的绿色果实中显著表达。一个显著的观察是，LcGA2ox4的转录水平在果皮中从绿色到黄色再到红色着色的发育序列中逐渐上调。这些发现意味着LcGA2ox4可能通过持续调控GA代谢途径，参与果实皮肤成熟和色素积累相关的生化机制。数据进一步表明，LcGA2ox8可能在高级成熟阶段发挥重要作用，而LcGA2ox5的早期表达模式指向其可能参与控制果实发育初期的GA浓度。

7.5. 荔枝雌雄花发育过程中LcGA2oxs的表达模式

对‘妃子笑’荔枝花发育的转录组分析显示，LcGA2ox基因家族成员具有不同的时序表达谱。值得注意的是，LcGA2ox4在两性花芽阶段（完全性分化之前）显示出显著的转录活性。研究发现LcGA2ox5和LcGA2ox9主要在雌蕊花形成的初始阶段（F1和F2阶段）活跃，而LcGA2ox1的表达显著局限于早期雄蕊花发育（M1和M2阶段）。在后期发育阶段，表达模式出现差异：LcGA2ox6和LcGA2ox7在雄蕊花高级成熟阶段（M3和M4阶段）变得具有转录活性，而LcGA2ox8的表达仅在雌蕊花终末发育阶段（F4阶段）达到峰值。这些结果表明，LcGA2ox4在性分化机制的启动中起关键作用。LcGA2ox5/9似乎通过在雌花发育开始时精确调节GA水平，在雌花的早期发育阶段，特别是心皮原基分化和分化中起关键作用。此外，LcGA2ox8可能通过在雌花发育后期调整GA水平，促进雌花性状的成熟，如心皮塑造和柱头开裂。在雄花中，LcGA2ox1通过在雄花发育早期调节GA代谢，参与早期发育过程，包括雄蕊原基分化和初始花丝发育。总之，研究结果表明LcGA2ox6和LcGA2ox7可能通过调节荔枝雄花发育后期的GA代谢，参与雄花的成熟，特别是花药成熟和花粉形成。

7.6. 荔枝不同花器官中LcGA2oxs的表达模式

在‘妃子笑’荔枝花器官内的表达谱分析表明，LcGA2ox5仅在雄花和两性花的雄蕊中显著表达。相反，LcGA2ox6/7在雄花和两性花的雄蕊和心皮中均显著表达。据推测，LcGA2ox5通过在雄蕊内局部降解活性GAs，维持雄蕊发育所需的“低GA环境”，确保花药成熟和花粉形成等关键功能，从而促进适当的雄蕊发育，同时防止雄蕊向心皮转变。此外，LcGA2ox6/7被认为通过在雄花和两性花中高表达、在雌花中低表达，在雄花和雌花之间创造了不同的GA环境和能量分配模式，这可能影响了荔枝花性分化的方向。值得注意的是，所有LcGA2ox基因在雌花的心皮中表达水平都较低，这可能是由于心皮在后续生殖过程中需要较高的GA水平来维持其 prolonged 生长和功能发育。

8. 关键LcGA2ox基因的共表达分析

利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)对荔枝雌雄花发育过程中的基因表达动态进行系统表征，以研究通过GA代谢途径调控两性花芽期花分化的调控机制。研究聚焦于变化最显著的8000个基因，通过详细检查模块与花发育阶段的关系，成功鉴定了参与此过程的关键LcGA2ox基因。本研究共识别出八个共表达模块。Notably, 蓝色模块与雄花发育的多个阶段（特别是M3和M4阶段）呈显著正相关。该模块中鉴定的LcGA2ox基因家族成员LcGA2ox6/7，可能影响荔枝雄花的发育进程。WGCNA模块的GO和KEGG注释表明，基因在两条核心生物通路中显著富集：植物激素信号的传递和二萜类化合物的产生（GA形成的基本构建模块）。这些发现表明，已鉴定的基因簇可能通过参与激素信号机制和调节GAs的产生，促进荔枝花的性分化。后续分析发现，LcGA2ox6/7与29个转录因子存在强共表达关系。在这些转录因子中，包括SEP1 (LITCHI019333)在内的16个与LcGA2ox6/7高度正相关，并在雄花中显著过表达。相反，包括AGL1 (LITCHI026995)和SPT (LITCHI010952)在内的13个转录因子与LcGA2ox6/7高度负相关，并在雌花中显著过表达。AGL1被认为是拟南芥心皮发育的标志基因，而SPT则是心皮形态发生的关键调控因子。这些发现不仅强调了LcGA2ox6/7参与雄花成熟，也为荔枝花性分化的分子调控提供了新见解。

9. 荔枝LcGA2ox6基因的功能分析

为了进一步阐明LcGA2ox6在调控植物生长发育中的功能作用，将荔枝LcGA2ox6基因的PCR扩增产物作为目标片段，通过同源重组与植物表达载体pCAMBIA2300连接，成功构建了LcGA2ox6基因的植物过表达载体。随后，利用农杆菌介导的花序浸蘸法在拟南芥（哥伦比亚生态型）中进行遗传转化。通过筛选和RT-qPCR分析，最终获得三个纯合、表型一致且靶基因高表达的转基因株系，用于进一步功能验证实验。

表型观察显示，在标准条件下生长52天后，与野生型(WT)相比，转基因植株表现出显著的矮化现象。此外，小花的长度明显缩短，并且雄蕊（花药）的附着位置显著低于雌蕊（柱头），阻碍了花粉有效地传递到柱头。这伴随着自交不育，表现为自然条件下自花授粉后角果无法正常发育，呈现出短小、皱缩和不育的特征。这些发现表明，过表达LcGA2ox6可以抑制拟南芥的营养和生殖发育，从而破坏花器官和果实的正常发育。

结论

本研究在荔枝中成功鉴定出9个LcGA2ox家族成员，每个成员都含有GA2ox家族特有的2OG-Fe(II)_Oxy和DIOX_N结构域。通过生物信息学分析，阐明了这些基因的理化性质、基因结构和进化特征。蛋白-蛋白互作预测表明LcGA2ox8可能是GA代谢和信号通路中的关键调控组件。表达模式分析揭示了明显的组织特异性和时空表达特性，突出了其在荔枝器官发育过程中的功能分化。值得注意的是，LcGA2ox6和LcGA2ox7在雄花发育后期优势表达，并与核心雌花基因AGL1和SPT呈强负相关，表明它们是荔枝雄花成熟和性分化的关键调控因子。通过在拟南芥中的过表达实验，进一步验证了LcGA2ox6对植物生长发育的抑制作用。这些发现为全面理解荔枝GA代谢网络奠定了重要的理论基础，并提供了通过分子育种策略揭示性分化关键调控因子、提升荔枝开花和生殖性能所必需的遗传资源。