《Plants》：From Gene Knockouts to Genome Remodeling: Large DNA Fragment Deletion Technologies in Plants
Jiayi Hou,
Hui Li,
Fengfeng Zhang,
Dan Yang,
Yan Xiong,
Xiaoyue Zhu and
Mingzhang Wen
编辑推荐：
这篇综述系统梳理了植物基因组工程领域的大DNA片段删除（LDFD）技术。文章比较了ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas（Cas9、Cas12a、Cas3）、位点特异性重组酶、转座子系统及先导编辑衍生策略等多种技术的机制、效率与优劣势，并指出当前在作物中实现高效、精准、可预测大规模删除的瓶颈。最后，作者展望了未来发展方向，包括AI辅助的核酸酶/重组酶设计、蛋白质定向进化及优化的递送系统，旨在将LDFD从专业工具转化为广泛应用于植物功能基因组学、性状工程和合成基因组设计的通用平台。
引言
大DNA片段删除（LDFD）被定义为一种精确移除基因组中连续、大片段（通常≥1 kb）的结构变异。它在植物研究中具有核心价值，包括阐明非编码区（如增强子、沉默子）的调控逻辑、解析基因剂量失衡如何影响表型、探索高级染色体结构重塑的生物学后果，以及为合成生物学提供基因组精简和优化的工具。通过模拟自然发生的结构变异，LDFD技术有助于构建性状模型和设计更高效的合成生物学系统。
基于双链断裂（DSB）的LDFD
基因编辑技术，如锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和CRISPR衍生系统，通过在特定位点引入DSBs来实现LDFD。ZFNs和TALENs将可定制的DNA结合域与非特异性FokI核酸酶结构域融合，其二聚化可在靶位点产生切割。其中，TALENs通常表现出比ZFNs更高的活性和高通量组装便利性。
CRISPR/Cas系统是一种适应性免疫机制。II型CRISPR/Cas9系统在原型间隔区相邻基序（PAM，如5′-NGG-3′）上游三个碱基对处产生DSB。Cas12a（Cpf1）识别T富集的PAM序列（如TTTN），并以交错切割方式产生粘性末端。I型CRISPR/Cas3系统则通过Cascade复合物识别目标DNA并招募Cas3，Cas3具有解旋酶和HD核酸酶活性，可对DNA进行单向、持续性的降解，因而在产生大规模缺失方面显示出独特优势。例如，源自Cas3平台的Dvu I-C系统在玉米和水稻中可实现超过80%的长片段（>1 kb）删除效率，通过配对crRNA甚至可操控至少20 kb的删除。
在同一基因或染色体上同时诱导两个靶位点的DSB，可通过非同源末端连接（NHEJ）、同源重组（HR）或微同源介导的末端连接（MMEJ）等修复途径实现靶向片段删除。NHEJ通路活跃于整个细胞周期，但易产生错误连接；HR具有高保真性，但受限于复杂的载体构建和细胞周期依赖性；MMEJ则依赖于短微同源序列（MHs）。在植物中，基于DSB技术的LDFD效率通常在1%至5%之间，但存在编辑效率低和连接处产生非预期副产物等问题。
基于位点特异性重组酶（SSR）的LDFD
位点特异性重组酶（如来自噬菌体P1的Cre重组酶和来自酿酒酵母的Flp重组酶）通过识别短DNA基序并催化高度精确的DNA重组（整合、切除、倒位）来实现LDFD。它们主要分为酪氨酸重组酶和丝氨酸重组酶家族。其中，酪氨酸重组酶能够实现植物基因组大片段的精确、无疤痕删除。
新开发的编程染色体工程（PCE）系统通过双pegRNA策略在目标删除片段两端插入LoxAR2和Lox71重组位点，然后由AI工程化的超活性Cre重组酶（如cm24，其重组效率比野生型高3.5倍）催化重组，可在水稻中切除800 kb至4 Mb的DNA片段，最大删除效率达1.0%。重组酶表达可由诱导系统（如蓝光、半乳糖/雌二醇、地塞米松）驱动，以实现LDFD的精确时空调控。
重组酶的一个主要应用是切除选择标记基因，产生无标记的转基因株系。分裂重组酶系统和可视化监测无DNA多基因编辑系统（VMDFGE）等策略进一步提高了生物安全性和操作灵活性。然而，重组酶在植物细胞中的活性通常低于微生物，且其切除效率与目标片段大小呈负相关，高序列特异性也限制了天然靶位点的数量。通过计算挖掘和深度学习（如RecGen）对重组酶进行理性设计和工程化，是克服这些瓶颈的互补策略。
基于先导编辑（PE）的LDFD
先导编辑（PE）系统由RNA编程的切口酶（nCas9）与逆转录酶（RT）的融合蛋白以及先导编辑向导RNA（pegRNA）组成。pegRNA包含指定基因组靶点的gRNA、引物结合位点（PBS）和编码所需编辑的逆转录酶模板（RTT）。该系统可直接重写DNA序列，实现精确编辑。
PE系统经过多代优化（PE1-PE7），通过蛋白质和RNA工程提高了效率和功能。基于PE衍生的方法，如DualPE系统，将植物优化的编辑器ePPEplus与双工程化epegRNAs结合，已在小麦中实现了约365.9 kb的可遗传LDFD，且其删除效率与片段长度无关。其他如PRIME-Del、twinPE、GRAND、PEDAR和PETI等方法，也利用双pegRNA策略促进了kb级甚至Mb级的DNA删除、替换或倒位。总体而言，基于PE的LDFD平台比传统的DSB方法具有更高的精度和效率。
基于转座子的LDFD
转座子占植物基因组的15-85%，根据转座机制分为I类逆转录转座子和II类DNA转座子。II类DNA转座子通过“剪切-粘贴”机制转座，广泛应用于植物中选择标记的切除。例如，源自粉纹夜蛾的piggyBac转座子已与CRISPR/Cas9整合，用于精确基因编辑后对转座子载体进行“清洁”切除，仅留下预期的基因组修饰。基于内源Ac/Ds转座子系统开发的TRUST系统，可在玉米中生成仅含目标表达框的超清洁转基因植株。
虽然转座子系统在靶向插入和LDFD中具有应用潜力，但该方法需要预先存在的转座子插入，并存在片段再整合的风险。此外，DNA甲基化等表观遗传调控网络会强烈抑制转座子活性。
LDFD技术系统的比较与选择
在植物LDFD中，不同技术各有特点和应用生态位：
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小片段删除（1–30 bp）和基因敲除：成熟的CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a是首选，它们兼容多重gRNA设计。
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中到大片段删除（5–100 kb）：具有持续核酸酶活性的CRISPR/Cas3通常在删除能力和效率上领先。
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无转基因编辑：重组酶能够无疤痕地切除转基因和选择标记，在非模式或无性繁殖作物中尤其有价值。病毒载体、农杆菌介导的瞬时表达和基因枪RNP递送也可实现无转基因编辑。
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超大片段删除（>100 kb）：PE衍生策略可为程序性删除提供更高精度，通过在靶区域两侧设计微同源序列引导MMEJ修复，是提高DSB依赖性LDFD准确性的潜在途径。
定向进化、深度学习与AI辅助的LDFD蛋白质设计
蛋白质工程，特别是定向进化，是推进LDFD技术的核心。策略包括随机诱变、理性诱变和基于重组的策略（如基因洗牌）。错误倾向PCR（epPCR）可产生大型突变体文库，而正交复制系统、噬菌体辅助连续进化（PACE）和IntePACE等连续体内定向进化平台，能够实现靶向基因的高效诱变和有益变体的快速富集。例如，通过PACE进化出的新型逆转录酶变体被用于开发PE6a–d系列先导编辑器，其中PE6c在水稻中显示出显著更高的编辑效率。近期在植物系统高通量筛选方面的突破，如双生病毒复制子辅助的植物体内定向进化（GRAPE），使得在短短四天内即可在单个本氏烟草叶片上筛选约105个突变体。
与此同时，深度学习已成为蛋白质工程的一种变革性方法。基于深度神经网络和大规模序列/结构数据集，现代深度学习模型可以学习蛋白质序列的高维表征，预测稳定性、活性等性质，并生成具有所需属性的新序列。例如，深度学习驱动的生成算法RecGen可高效预测能够靶向新DNA识别位点的功能性重组酶。AI引导的连续进化管道可以迭代地提出有益突变，进行计算机评估，并将优先变体送入高通量实验筛选。例如，通过AiCErec方法进化出的Cre重组酶突变体cm24，其重组效率比野生型高3.5倍，并已成功应用于植物的LDFD。AI工具如RFdiffusion和AlphaFold3能够从头生成和进行结构引导的蛋白质及蛋白质复合物精修。
结论与展望
在植物系统中，基于ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas、位点特异性重组酶、先导编辑和转座子的LDFD平台各具优势和局限性。展望未来，基因组编辑技术将持续精进，以解决当前LDFD的瓶颈。未来的努力将集中于开发在kb-Mb尺度上具有更高删除效率、对删除边界有更好控制、在复杂植物基因组中具有更广泛靶向范围，以及针对不同作物物种具有更灵活递送策略的系统。同时，在复杂的真核基因组中优化编辑的精确性和安全性，对于实现LDFD在功能基因组学和性状工程中的常规应用至关重要。随着这些进展的汇聚，LDFD技术有望从专业工具演变为广泛可用的平台，加速基础植物生物学研究和改良作物品种的理性设计。
