韭葱（Allium tuberosum）通过离体雌核发生体系优化与转录组分析：从未受精子房到植株形成的机制探索

《Agronomy》：Optimization of Cultivation System and Transcriptome Analysis: From Unpollinated Chinese Chive Ovules to Plant Formation Qing-Qing Wang, Bao-Hui Zhang, Li-Fen Zhao, Ning Ao, Lian Tao, Bing Tang, Chuan-Yuan Mo, Wei Yang, Wen-Yuan Fu and Ying Deng

本研究针对韭葱（Allium tuberosum）单倍体育种中存在的基因型依赖性强、再生效率低等瓶颈，通过系统优化离体未受精子房培养体系，筛选出最高胚诱导率可达86.67%的基因型‘21-CJ46’及其最优培养条件（MS培养基+90 g/L蔗糖+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，25℃培养）。流式细胞术与染色体计数表明再生植株存在高频自发染色体加倍现象。转录组分析揭示，在培养14天时，子房发生了广泛的转录重编程，苯丙烷生物合成、植物-病原互作、植物激素信号转导等通路显著富集，胚胎发生关键调控因子（如BBM2、WUSCHEL9、LEC、PLT2、ABI3）被显著激活。该研究为提高韭葱雌核发生效率及解析其分子机制提供了重要参考。

　　

韭葱（Allium tuberosum）通过离体雌核发生体系优化与转录组分析：从未受精子房到植株形成的机制探索

1. 引言

韭葱（Allium tuberosum Rottler ex Spr.）是一种重要的蔬菜作物，因其独特风味和营养价值在东亚和中亚广泛栽培。其遗传高度杂合，花部雌雄蕊异熟促使其异交，使得通过传统自交方式进行性状固定具有挑战性，育种过程漫长且费力。单倍体诱导技术提供了一种能在单一代内产生纯合双单倍体（DH）系的有效途径，从而加速等位基因固定和均匀品种的开发。离体雌核发生，包括培养未受精子房或胚珠，是关键的单倍体诱导途径，尤其适用于花药培养反应性低的物种。此过程将雌配子体从配子体途径重编程向孢子体途径，从而实现不受精条件下的胚胎发生。在葱属植物中，雌核发生已被用于洋葱、韭葱和韭黄的等单倍体生产。然而，该技术在韭葱育种中的应用仍受到诱导率不稳定、基因型依赖性强、外植体发育阶段和培养条件等因素的严重限制。此外，对韭葱中雌配子体向胚胎转变的分子机制也缺乏深入认识。胚胎发生的重编程涉及复杂的转录调控网络。本研究旨在通过筛选影响韭葱离体未受精子房培养胚胎形成的关键因子，并分析其转录组变化，为优化诱导体系和理解雌核发生的分子机制提供依据。

2. 材料与方法

本研究共使用了20个韭葱基因型，包括5个宽叶韭（Allium hookeri）材料、8个地方农家种和7个商品栽培种。以开花前1天的花蕾为外植体。经表面消毒后，分离出带花梗的子房，接种于诱导培养基上。首先，利用一个初步诱导配方对20个基因型进行雌核发生响应能力的筛选。以筛选出的响应最强基因型‘21-CJ46’为材料，进一步评估了多种影响因素。包括：开花时期（初花期、盛花期、末花期）和子房发育阶段（开花当天及开花前1、2、3、4天）；物理培养条件（热激33℃、冷激4℃处理1-4天，以及25℃黑暗或光照培养）；以及培养基成分（不同浓度蔗糖与激素6-BA、2,4-D的组合）。胚胎诱导率统计于接种后35天。对诱导出的不定芽，进一步筛选了增殖培养基（不同比例6-BA与NAA的组合）。对再生植株的生根、驯化与移栽条件也进行了优化测试。通过流式细胞术和根尖染色体计数鉴定再生植株的染色体倍性。对‘21-CJ46’在培养0天（对照）和14天（诱导期）的子房组织进行转录组测序，通过差异表达分析、GO功能富集和KEGG通路富集，解析与雌核发生起始相关的分子事件。并利用qRT-PCR对6个胚胎发生相关的候选基因（BBM2、WUSCHEL9、LEC、PLT2、ABI3、ABI4）进行表达验证。所有实验采用完全随机设计，数据统计分析采用Python（3.11.2版本）进行正态性和方差齐性检验，满足条件的进行单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较。

3. 结果

3.1. 影响离体未受精子房培养胚状体诱导的关键因素

基因型是影响胚胎诱导的首要限制因素。20个基因型中，5个宽叶韭基因型完全无反应（诱导率0.00%），而栽培韭葱基因型表现出不同程度的响应。在7个商品种中，‘21-CJ46’诱导响应最强，诱导率可达约80%。因此选定‘21-CJ46’进行后续体系优化。

在开花阶段筛选中，初花期和盛花期是合适的采集时期，而在末花期采样会显著降低诱导率。在开花时期内，开花前1天（-1 d）采集的子房诱导率最高，显著优于开花当天（0 d）或开花前3-4天采集的子房。

在物理培养条件筛选中，在25℃光照培养室中直接培养诱导率最高。4℃冷激处理1-2天与25℃对照无显著差异，但处理3-4天会显著抑制诱导。黑暗培养和33℃热激处理均会抑制胚状体形成。

蔗糖浓度与激素组合存在互作效应。9%（90 g/L）的蔗糖浓度在多种激素组合下表现普遍最优，优于3%、6%或12%的浓度。在9%蔗糖条件下，1.0 mg/L 6-BA 与 0.2 mg/L 2,4-D的组合产生了最高的平均诱导率（86.67%），被确定为最优配方。

最后，将优化体系（25℃，开花前1天子房，90 g/L蔗糖 + 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2,4-D）重新应用于全部20个基因型进行评估。优化条件显著提高了部分基因型（如‘20-CJ28’、‘20-CJ29’和‘21-CJ47’）的诱导率。但对于本已高响应基因型如‘21-CJ46’，虽然平均值有所提高，但由于方差原因未达统计显著。宽叶韭基因型依然无反应，表明培养基和培养条件的优化未能克服其遗传限制。

3.2. 胚胎发育过程中的形态学观察

在优化培养条件下观察了雌核发生过程中的形态学变化。接种初期，子房保持绿色、紧实。培养约14天后，成功的诱导表现为胚珠内出现明显的白色球状结构，周围组织呈现局部半透明化。未诱导的子房仅表现为部分半透明，但未形成此类结构。随着培养继续，球状胚突破子房壁，经历极化过程，发育成不规则的二极结构，随后绿化并分化为具有可见茎和根的完整小植株。

3.3. 染色体倍性鉴定

对100株随机选择的再生植株进行流式细胞术和根尖染色体计数分析，观察到了两个特征性的DNA含量峰：一个对应二倍体（2n）的峰（约200荧光强度单位），另一个对应四倍体（4n）的峰（约400荧光强度单位）。染色体计数结果与此相符。在100株再生植株中，四倍体占28%，二倍体占72%，表明在该体系中存在高频的自发染色体加倍现象。由于供体品种‘21-CJ46’是同源四倍体（2n = 4x = 32），因此显示出二倍体DNA含量（2n = 2x = 16）的再生植株代表了由配子体细胞起源的、预期的倍性减半（单倍体）产物。而表现出四倍体（4n = 4x = 32）峰值的再生植株则是在离体培养阶段发生了自发染色体加倍的群体。

3.4. 激素配比对不定芽增殖的影响

在增殖体系优化中，含0.5 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA的培养基产生了最高的增殖系数（约3.8），支持稳定的芽生长。在生根阶段，无激素的MS培养基（MS + 30 g/L蔗糖 + 9 g/L琼脂）生根表现最佳，生根启动时间约5天，平均每株生根8-11条，根粗壮且根毛丰富。相比之下，添加NAA的培养基会延迟生根（7-9天）、减少生根数量并使根变细。在五种移栽基质混合物中，T2（泥炭:椰糠:牛粪:珍珠岩 = 4:2:1:1, v/v）表现最佳，各项生长指标（根数、根长、假茎长、叶片数、鲜重）均优于其他处理，且移栽后存活率达100%。

3.5. 雌核发生诱导过程中的转录组分析

为探究上述形态转变相关的分子变化，对‘21-CJ46’在培养0天和14天的子房进行了RNA-seq分析。共鉴定出8730个差异表达基因（DEGs），其中4120个上调，4610个下调。GO富集分析表明，在生物过程中，光合作用相关通路显著下调。在细胞组分层面，质膜和膜的整合成分显著富集，表明膜相关基因表达发生广泛变化。在分子功能层面，转录因子活性和蛋白激酶活性的富集，表明转录调控和信号传导发生了重大重构。

KEGG通路富集分析揭示了与雌核发生起始相关的通路。苯丙烷生物合成通路显著富集，与活跃的细胞壁重塑一致。植物-病原互作和谷胱甘肽代谢通路也高度富集，表明早期培养中存在应激适应和氧化还原调节。在信号传导方面，植物激素信号转导和MAPK信号通路显著富集，与细胞对培养基中外源2,4-D和6-BA的响应及细胞内信号级联激活相一致。淀粉和蔗糖代谢的富集与优化培养基中高蔗糖（90 g/L）的要求相符。基于DEG谱，重点关注了胚胎发生相关的调控因子。BBM、WUSCHEL、LEC、PLT和ABI基因家族成员在0天时表达量极低，但在14天时被强烈诱导，支持了其在离体未受精子房培养中与胚胎命运获得相关。

qRT-PCR验证结果总体上与RNA-seq趋势一致。BBM2、WUSCHEL9、LEC、PLT2和ABI3在14天时表现出显著上调。BBM2和WUSCHEL9上调幅度最大，符合其作为主要调控因子的潜在作用。而ABI4的结果在两种方法间存在差异：RNA-seq显示其在14天时转录本丰度增加，但qRT-PCR未检测到显著变化。这种差异可能反映了方法灵敏度差异或引物对不同剪接变体的选择性。

4. 讨论

基因型依赖性是在多种植物物种中离体胚胎发生和愈伤组织诱导的普遍特征。在本研究的20个基因型中，胚状体诱导率差异显著，其中‘21-CJ46’诱导反应最强，而所有宽叶韭基因型均未能产生胚状体。这与先前关于韭葱和其他葱属植物雌核发生反应强烈依赖于供体遗传背景的报道一致。对于难以再生的物种，识别高响应基因型是建立稳定诱导体系的前提。

在本体系中，温度胁迫并非诱导胚胎发生所必需。直接在25℃培养获得了最高的诱导率，而热激（33℃）处理导致组织严重褐化并降低了诱导率。这不同于一些常通过热或冷激处理来中断配子体发育、促进孢子体重编程的物种。优化后的蔗糖浓度（90 g/L）也与此前关于韭葱的报道一致。除了作为碳源，高浓度蔗糖可能产生的渗透压成分，可抑制非胚胎性生长并促进胚胎性分裂，类似于其他体系中描述的渗透效应。

流式细胞术和染色体计数表明再生植株中存在频繁的自发染色体加倍。自发加倍在葱属植物雌核发生中已有报道，可减少对化学染色体加倍步骤的依赖。然而，对2n和4n再生植株的解释需基于供体的倍性背景进行考量。

0天与14天之间的转录组比较揭示了胚胎发生起始过程中高度协调的细胞重编程序列。苯丙烷生物合成、植物-病原互作和谷胱甘肽代谢通路的显著富集表明，离体子房将高渗透压（90 g/L蔗糖）和组织离体作为独特的生理胁迫来感知。同时，MAPK信号传导和植物激素信号转导通路的显著富集，是外源激素信号（2,4-D和6-BA）转化为内在转录级联的机制桥梁。我们提出了一个调控模型，认为这种胁迫适应和外源激素信号的整合，瓦解了配子体发育程序，并直接驱动了细胞全能性的强烈激活。具体而言，这个胁迫-激素信号轴最终导致了胚胎发生核心调控因子（如BBM2、WUSCHEL9、LEC、PLT2、ABI3）在14天时从近乎无到高表达的转变。BBM是全能性的核心调控因子，其异位表达可诱导胚胎发生。WUS和PLT的上调则提示了干细胞样生态位和胚胎模式构建的从头建立。同时，LAFL网络成员（包括LEC和ABI3）的激活进一步支持了胚胎发育程序的启动。尽管这些关键调控因子显示出高度的一致性，但ABI4的表达存在明显差异。这种分歧可合理地解释为，RNA-seq可全局定量所有已组装的转录本异构体，而qRT-PCR则严格扩增单一的编码区域，再加之应激响应基因常见的表达短暂且波动性强，导致了检测结果的差异。

5. 结论

本研究为韭葱建立了一个高效的离体雌核发生体系，在高响应品种‘21-CJ46’中实现了高达86.67%的最高胚胎诱导率。最优参数为：开花前1天采集的子房，在添加了90 g/L蔗糖、1.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L 2,4-D的MS培养基上于25℃培养，且无需剧烈的温度胁迫处理。关键的发育里程碑出现在培养约14天时，其特征是明显的形态学转变，包括子房组织局部半透明化和肉眼可见的球状胚的出现。转录组分析揭示，这一形态转变伴随着广泛的转录组重编程。离体环境作为一个独特的生理胁迫，激活了胁迫响应通路（如苯丙烷生物合成）和MAPK/激素信号转导，它们共同作用瓦解了配子体发育程序，并驱动了核心全能性和胚胎发生调控因子（特别是BBM2、WUSCHEL9、PLT2、LEC和ABI3）的从头激活。在应用层面，再生植株中观察到的高频自发染色体加倍现象，显著降低了对化学加倍步骤的依赖。这一优化方案，结合所绘制的转录组调控网络，为产生韭葱纯合系提供了直接且高效的框架，从而加速韭葱的现代育种进程。