《Fermentation》：Enzymatic Production of Phosphatidylserine Using a Phospholipase D Immobilized via a Composite Polysaccharide Strategy
Mengyao Li,
Zequn Zhang,
Jingyu Chen,
Hui Sun,
Fuping Lu,
Yihao Liu and
Yihan Liu
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本研究成功构建了一种整合了壳聚糖柔性、纤维素稳定性和琼脂糖大孔性的三元复合多糖载体，用于固定化链霉菌来源的磷脂酶D（saPLD）。所制备的saPLD@壳聚糖-纤维素-琼脂糖生物催化剂在磷脂酰丝氨酸（PS）的酶法生产中展现出优于游离酶的固定化效率、催化性能和稳定性，在连续使用八个批次后，PS产率仍保持在首个批次的60%以上，为PS的高效可持续生产提供了一个稳健且前景广阔的平台。
酶法合成磷脂酰丝氨酸的研究进展及新型固定化策略
引言
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）是一种在食品、制药和化妆品工业中具有重要应用价值的磷脂。它在脂质体药物递送系统中是关键成分，在化妆品配方中作为生物相容性表面活性剂，并因其对认知功能、记忆改善等方面的有益作用而被广泛用作膳食补充剂，尤其对与神经退行性疾病相关的老年患者有益。传统上，PS来源于牛脑等动物组织，但存在传播传染病的风险。从大豆、蛋黄等生物质中提取则步骤繁琐、产率低。相比之下，在温和条件下由磷脂酶D（Phospholipase D, PLD）催化磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine, PC）与L-丝氨酸进行转磷脂酰化反应的酶法合成，因其环境友好和条件温和而备受关注。
然而，游离PLD的工业应用受到稳定性差、难以回收和成本高等因素的限制。酶固定化是克服这些局限的有效策略，可提高酶的稳定性、便于操作和重复利用。在众多固定化载体中，多糖基载体因其易得、易制备、生物相容性、无毒、可生物降解和生理惰性等优良特性而受到青睐。但单一多糖载体在结构机械强度、传质效率和化学稳定性方面存在不足。为解决这些问题，本研究构建了一种整合了壳聚糖柔性、纤维素稳定性和琼脂糖大孔性的三元复合载体，用于固定化来自链霉菌（Streptomyces antibioticus）的PLD（saPLD），并对所制备的生物催化剂进行了系统表征和性能评估。
材料与方法
载体制备与表征
研究首先通过挤出法，将溶解在5%醋酸溶液中的壳聚糖、纤维素和琼脂糖混合粉末滴入含有NaOH和乙醇的凝固浴中，制备了不同质量比例的多糖复合微球载体。载体比例包括壳聚糖-纤维素（3:1, 4:1, 5:1）和壳聚糖-纤维素-琼脂糖（4:1:1, 4:1:0.5, 4:1:0.25）。利用扫描电子显微镜（SEM）观察载体的表面形貌。结果显示，当壳聚糖与纤维素比例为4:1时，载体的孔隙分布均匀，呈现出利于质量传递的三维网络结构。进一步添加0.5份琼脂糖（比例4:1:0.5）后，载体表面变得更加多孔、粗糙且松散，理论上更有利于saPLD的固定化。
通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析了载体的官能团。壳聚糖载体显示出O-H/N-H、C-H、C=O、N-H等特征吸收峰。在复合载体中，随着纤维素和琼脂糖的加入，O-H峰的位移表明分子间形成了新的氢键。特别值得注意的是，表征-COOH的基团是酶分子固定化的关键结合位点。在4:1:0.5比例的壳聚糖-纤维素-琼脂糖载体中，-OH基团的峰面积更大，表明其表面有更丰富的、可用于与戊二醛交联和与酶分子结合的活性羟基位点，理论上对游离saPLD具有良好的结合能力。
固定化条件优化
从重组枯草芽孢杆菌中表达并纯化得到高纯度的saPLD，其酶活为110.22 U/mL，比活力为45.12 U/mg。固定化过程涉及用戊二醛对载体进行交联，随后吸附游离的saPLD。研究系统优化了戊二醛浓度、交联温度、交联时间、吸附温度和吸附时间。
结果表明，以壳聚糖-纤维素-琼脂糖（4:1:0.5）为载体，在0.1%的戊二醛浓度、20°C下交联3小时，然后在20°C下吸附saPLD 2小时，可获得最高的酶活回收率，达到87.77%。在优化过程中，戊二醛作为交联剂，与载体和酶表面的氨基反应，适量的戊二醛可形成防止酶浸出的交联网络，但浓度过高会导致酶失活或载体孔隙减少。交联温度和时间的延长也会影响交联网络的形成和酶的构象，存在一个平衡点。较低的吸附温度（20°C）有利于防止酶的热失活，而适当的吸附时间（2-3小时）确保了充分的结合，时间过长则可能导致已吸附的酶因分子动力学增加而脱离。
固定化酶（saPLD@壳聚糖-纤维素-琼脂糖）的酶学性质
固定化并没有改变酶的最近催化条件。游离saPLD和固定化酶的最适反应温度均为60°C，最近pH均为6.0。但在热稳定性和pH稳定性方面，固定化酶表现出显著提升。
在60°C下孵育1小时后，固定化酶的残余酶活保持在90%左右，而游离酶的残余酶活则急剧下降至约20%。在pH 6.0、7.0和8.0的缓冲液中预孵育7天后，固定化酶的残余酶活分别为103.45%、101.64%和98.95%，均高于游离酶的对应数值（100%、97.23%、95.05%）。这种稳定性的提升，归因于载体限制了saPLD分子不利的构象变化，并对其活性结构起到了保护作用，增强了酶的刚性。
固定化酶的批次催化效率与可重复使用性
研究人员评估了固定化生物催化剂在连续批次反应中的性能。如图5所示，在连续进行八个批次的PS催化生产后，saPLD@壳聚糖-纤维素-琼脂糖的PS产率仍保持在第一个批次产率的60%以上。
产率随使用批次增加而下降的原因，可归结为反应体系中的溶剂对生物催化剂的影响、酶在使用过程中逐渐失活，以及在回收步骤（如洗涤和离心）中部分固定化酶的损失。尽管如此，相比于此前报道的其他固定化PLD系统，本研究开发的复合载体在多个批次循环中表现出了更优的操作稳定性。
结论
本研究成功地将saPLD固定于壳聚糖-纤维素-琼脂糖（4:1:0.5）三元复合多糖载体上，构建了一种新型生物催化剂saPLD@壳聚糖-纤维素-琼脂糖。与游离酶相比，该固定化酶展现出显著增强的热稳定性和pH稳定性。更重要的是，在连续使用八个批次后，其PS产率仍可维持在首轮产率的60%以上，显示出优异的可重复使用性和实际应用潜力。该工作为PS的高效、可持续生产建立了一个稳健且前景广阔的生物催化平台。
