SpNAC089通过直接激活SpREFl增强东南景天镉耐受性：一个用于优化镉污染土壤植物修复的候选基因

《Horticulturae》：SpNAC089 Confers Cadmium Tolerance in Sedum plumbizincicola by Binding to and Activating SpREFl Promoter Ruoyu He, Chenjia Zheng, Tianheng Jiang, Renying Zhuo, Zhengquan He and Wenmin Qiu

镉污染是严重的环境与健康威胁。东南景天是典型的镉超富集植物。本研究揭示了转录因子SpNAC089通过直接结合并激活SpREFl启动子，上调抗氧化酶(SOD, POD)活性、降低丙二醛(MDA)含量，从而增强镉耐受、减少植物镉积累的分子通路。该发现为利用基因工程优化植物修复技术提供了新靶点。

　　

1. 引言

全球工业化与城市化导致重金属镉(Cd)污染加剧，对植物生长、人类健康构成严重威胁。植物修复作为一种绿色可持续策略备受关注。东南景天(Sedum plumbizincicola)作为一种代表性的镉超富集植物，是研究镉耐受机制的理想模型。NAC转录因子家族是植物中最大的家族之一，在多种非生物胁迫响应中发挥核心调控作用。实验室前期研究发现橡胶延伸因子基因SpREFl可增强东南景天的镉耐受性，并通过酵母单杂交筛选鉴定出SpNAC089是其潜在的上游转录因子。本研究旨在系统阐明SpNAC089在东南景天中调控SpREFl进而影响镉耐受的分子机制，以期为改良植物修复技术和提高作物镉耐受性提供理论依据。

2. 材料与方法

2.1. 植物材料与生长条件

东南景天扦插苗在气候室中用1/2霍格兰营养液培养。经过30天生长后，选择生长一致的3厘米枝条，在去离子水中生根3周，随后转移到含10 μM CdCl₂的1/2霍格兰营养液中进行镉胁迫处理7天，收集组织用于后续分析。

2.2. 序列与系统发育分析

从东南景天转录组数据中获取SpNAC089的全长cDNA序列。通过在线工具预测其开放阅读框(ORF)和亚细胞定位。通过构建进化树分析其与拟南芥等物种NAC家族成员的亲缘关系。提取SpNAC089起始密码子ATG上游2000 bp启动子序列，利用PlantCARE数据库预测其顺式作用元件。

2.3. 表达载体的构建与转基因植物的获得

将SpNAC089的ORF克隆到pCAMBIA1300载体中，构建过表达载体pCAMBIA1300-SpNAC089，并通过农杆菌介导法转化东南景天的近缘种S. alfredii的叶片外植体。经过筛选培养基诱导愈伤组织、分化芽和生根，获得转基因植株。通过PCR和qRT–PCR鉴定阳性株系并检测其转录水平。

2.4. 转录激活活性与亚细胞定位分析

将SpNAC089的ORF克隆到pGBKT7载体中，转化酵母Y2HGold菌株，通过SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal培养基上的生长和显色情况检测其转录激活活性。将SpNAC089与GFP融合构建pCAMBIA1302-SpNAC089-GFP载体，通过农杆菌瞬时侵染本氏烟草叶片，利用激光共聚焦显微镜观察GFP信号与细胞核标记NLS-mCherry的共定位情况，以确定其亚细胞定位。

2.5. 生理指标与镉含量测定

测定野生型和转基因植株在镉胁迫下的超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量。收集植株的根、茎、叶组织，清洗、消化后，使用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定各组织中的镉含量。

2.6. 转录调控机制的验证

通过酵母单杂交实验验证SpNAC089与SpREFl启动子的结合，并利用截短的启动子片段（1-500 bp, 501-1000 bp, 1001-1500 bp, 1501-2000 bp等）将结合区域精确定位到1801-1950 bp。在烟草叶片中进行萤光素酶互补成像(LUC)实验，验证SpNAC089对SpREFl启动子的转录激活能力。通过电泳迁移率变动分析(EMSA)，使用纯化的GST-SpNAC089蛋白和生物素标记的启动子探针，进一步确认其直接、特异的结合。

3. 结果

3.1. SpNAC089的序列分析与功能预测

SpNAC089的全长cDNA为1263 bp，编码一个420个氨基酸的蛋白，预测分子量为46.8 kDa。系统发育分析显示SpNAC089与拟南芥的ANAC014亲缘关系最近，后者参与非生物胁迫响应。跨膜结构域预测表明其无跨膜区。启动子区顺式作用元件分析发现，其含有多个与非生物胁迫及激素响应相关的元件，如MYB、MYC、ABRE、TCA、ERE等，提示其表达可能受多种胁迫和激素信号调控。

3.2. SpNAC089定位于细胞核并具有转录激活活性

亚细胞定位实验显示，SpNAC089-GFP融合蛋白的信号与细胞核标记NLS-mCherry完全重叠，证实其特异性定位于细胞核。酵母转录激活实验显示，携带pGBKT7-SpNAC089的酵母细胞能在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上生长并使X-α-gal变蓝，证明其具有内在的转录激活活性。

3.3. SpNAC089过表达转基因株系的获得与鉴定

通过农杆菌介导的遗传转化，获得了3个SpNAC089过表达的东南景天转基因株系OE1、OE2和OE3。PCR和qRT–PCR分析证实了目标片段的成功整合和SpNAC089转录水平在转基因株系中的显著提高。

3.4. SpNAC089过表达增强镉耐受性并减少镉积累

在10 μM CdCl₂胁迫下，野生型植株表现出明显的叶片黄化和萎蔫，而过表达株系则生长相对正常，叶片黄化现象更轻。转基因株系在根、茎、叶中的镉积累量均显著低于野生型。生理指标测定显示，在镉胁迫下，过表达株系维持了显著更高的SOD和POD活性，并具有更低的MDA含量，表明其抗氧化能力增强，氧化损伤减轻。

3.5. SpNAC089直接结合并激活SpREFl启动子

酵母单杂交实验证实SpNAC089能与SpREFl的2000 bp启动子片段特异性结合。通过截短启动子分析，将结合区域精确定位到1801-1950 bp。LUC实验显示，SpNAC089能显著激活SpREFl启动子的转录活性。EMSA进一步证实，纯化的GST-SpNAC089蛋白能与标记的1801-1950 bp启动子探针形成特异的DNA-蛋白复合物，且该结合可被过量的非标记探针竞争抑制。对该结合区域的序列分析发现其中含有MBS和TCA顺式作用元件。

4. 讨论

4.1. SpNAC089通过调控抗氧化能力和镉积累来增强镉耐受

NAC转录因子是植物非生物胁迫响应的核心调控因子。本研究证实，SpNAC089通过提高抗氧化酶（SOD、POD）活性、降低MDA含量来增强东南景天的抗氧化能力，从而减轻镉胁迫引起的氧化损伤。同时，过表达SpNAC089导致植物各组织中镉积累量减少，这种“增强耐受性”与“减少积累”相结合的表型，可能代表了东南景天在镉污染环境中的一种适应性机制，为植物修复的遗传改良提供了优势方向。

4.2. SpNAC089通过结合MBS和TCA元件直接调控SpREFl表达

转录因子通过与靶基因启动子中的特定顺式作用元件结合发挥功能。本研究证实SpNAC089直接结合在SpREFl启动子的1801-1950 bp区域，并激活其转录，从而在SpNAC089与SpREFl之间建立了直接的调控关系。该结合区域含有MBS和TCA元件，暗示了镉胁迫响应与干旱胁迫、水杨酸(SA)信号途径之间的交叉对话。这一发现也拓展了REF家族基因的功能认知，揭示了其在重金属胁迫响应中的新角色。

5. 结论

本研究系统阐明了转录因子SpNAC089在东南景天镉耐受中的功能与调控机制。SpNAC089是一个定位于细胞核、具有转录激活活性的NAC家族转录因子。过表达SpNAC089能通过提高抗氧化酶活性、减少镉积累来增强植物的镉耐受性。在分子机制上，SpNAC089通过直接结合SpREFl启动子中1801-1950 bp区域（含有MBS和TCA元件）并激活其转录，形成了一条新的SpNAC089-SpREFl调控通路。该研究深化了对东南景天镉耐受分子机制的理解，并为通过基因工程改良镉污染土壤植物修复效率提供了一个候选基因（SpNAC089）。