《Horticulturae》：Characterization of the Dof Family Members in Citrus clementina (Hort. ex Tan.) and Functional Analysis of CcDof4 and CcDof6 in Phytophthora parasitica Resistance
Lina Hu,
Yuanda Lv,
Yutong Xie,
Jie Yu and
Huaxue Yan
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本文全面鉴定并系统分析了柑橘（Citrus clementina）Dof（DNA-binding with one finger）转录因子家族的24个成员。研究发现，CcDof4和CcDof6的瞬时过表达可显著增强柑橘对寄生疫霉菌的抗性，其机制与激活水杨酸（SA）信号通路关键基因NPR1和PR1的表达密切相关。这项工作不仅为深入理解Dof家族在柑橘生长发育及逆境响应中的调控网络提供了重要基础，更为培育抗病柑橘新种质提供了关键的候选基因和理论依据。
柑橘Dof转录因子家族的系统鉴定与功能分析
1. 引言
在自然界中，植物面临着多种生存挑战，包括生物胁迫（如植物病原体、害虫）和非生物胁迫（如寒冷、盐碱）。这些胁迫因子会严重影响植物的生长发育，最终导致农业上作物产量和品质的下降。为了应对这些条件，植物进化出了复杂的基因调控网络，以响应环境信号精细调节基因表达。转录因子在其中扮演了关键角色，它们通过结合特定启动子或增强子区域来调控靶基因的转录。其中，Dof（DNA结合单指）家族是植物特有的一类转录因子，在调控生长、发育和胁迫响应中发挥重要作用。该家族成员通常包含200-400个氨基酸，其N端具有一个保守的Dof结构域，其中含有一个C2C2型锌指基序，可特异性识别并结合靶基因启动子中的顺式调控元件5‘-(T/A)AAAG-3’。Dof家族成员已在多种植物中被鉴定，并展现出多样的功能。柑橘是全球重要的经济作物，其生产正日益受到生物和非生物胁迫的影响。因此，对柑橘Dof家族进行全面分析，对于揭示其在胁迫下的进化动态和功能适应至关重要。本研究旨在系统鉴定和分析柑橘（Citrus clementina）中的Dof家族，重点探究其在病原体侵染等胁迫响应中的功能。
2. 材料与方法
本研究使用了健康的克莱门汀柑橘（C. clementina）幼苗和成年树的不同组织（根、茎、叶、花、果实）样品。通过激素处理（ABA、SA、GA3、MeJA）、低温胁迫（4°C）以及接种寄生疫霉菌（Phytophthora parasitica）来诱导胁迫响应。利用生物信息学工具（TBtools-II, MEGA 11, PlantCARE等）从柑橘基因组中鉴定Dof基因，并进行系统发育、基因结构、保守基序、染色体定位、顺式调控元件等分析。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析了CcDof基因在不同组织、不同胁迫处理下的表达模式。通过农杆菌介导的瞬时过表达技术，在柑橘叶片中过表达候选CcDof基因（CcDof4、CcDof6），并评估其对寄生疫霉菌的抗性变化。同时，检测了过表达植株中水杨酸信号通路标记基因NPR1和PR1的表达水平。
3. 结果
3.1. CcDof基因家族成员的鉴定
本研究从柑橘基因组中鉴定出24个非冗余的Dof基因，命名为CcDof1至CcDof24。对编码蛋白的理化性质分析显示，其长度差异较大，平均长度为336个氨基酸。理论等电点变化范围广。大多数蛋白被预测为不稳定且具有亲水性。亚细胞定位预测表明，所有24个CcDof蛋白均定位于细胞核。
3.2. Dof基因家族的系统发育分析
基于柑橘、番茄和拟南芥Dof蛋白氨基酸序列构建的系统发育树显示，这些蛋白被分为六个不同的分支（I至VI）。每个分支都包含来自三个物种的代表，表明Dof基因家族在进化上具有高度保守性。
3.3. CcDof家族的基因结构、保守基序和结构域分析
基因结构分析表明，大部分CcDof基因（22个）不含内含子或仅含有一个内含子。保守基序分析鉴定出10个不同的基序，其中基序1存在于所有CcDof蛋白中。结构域分析证实，除CcDof24外，所有CcDof蛋白均包含特征性的Zf-Dof结构域。值得注意的是，属于同一进化分支的成员具有高度相似的基序组成，暗示它们可能具有相似或相关的生物学功能。
3.4. Dof基因家族成员的染色体定位与共线性分析
染色体定位显示，CcDof基因在柑橘的7条染色体（2至8号）上分布不均匀，其中3号染色体上的成员数量最多。种内共线性分析发现了多个共线性基因对，表明这些Dof基因所在的染色体区段在柑橘进化过程中经历了片段重复事件。
3.5. CcDof基因启动子区域的顺式调控元件分析
对启动子区（起始密码子上游2000 bp）顺式调控元件的分析发现了十类响应元件，包括光响应、激素（SA、MeJA、生长素、GA、ABA）响应、低温、干旱、防御和伤口响应等。其中，光响应元件存在于所有CcDof基因的启动子中，且数量最多。约80%的启动子含有MeJA和ABA响应元件，约一半含有生长素和GA响应元件。
3.6. CcDof基因在柑橘组织中的表达分析
组织特异性表达谱显示，所有CcDof基因均表现出组织特异性表达模式。八个基因在叶片中高表达，十三个基因在茎中表达最高，CcDof5和CcDof24在花中表达最丰富，而CcDof11主要在根中表达。这表明大多数CcDof基因在营养器官中高表达。
3.7. CcDof基因对植物激素处理的响应
基于启动子分析结果，研究了CcDof基因在外源ABA、SA、GA和MeJA处理下的表达模式。不同基因对不同激素的响应存在显著差异。例如，ABA显著诱导了CcDof3、CcDof4、CcDof5、CcDof7、CcDof8、CcDof19、CcDof20、CcDof21、CcDof22和CcDof23的表达，其中CcDof5的诱导幅度最大（约40倍）。SA处理强烈诱导了CcDof5、CcDof7、CcDof19、CcDof21、CcDof22和CcDof23的表达。GA和MeJA处理也分别特异性诱导或抑制了不同CcDof基因的表达。
3.8. 低温胁迫下CcDof基因的表达
在低温（4°C）胁迫下，CcDof基因表现出不同的时间依赖性表达模式。大部分基因在胁迫3小时内迅速下调。相反，CcDof1、CcDof7、CcDof19、CcDof21和CcDof23在低温胁迫下被显著上调，其中CcDof1的诱导最为强烈（超过11倍）。
3.9. CcDof基因对寄生疫霉菌侵染的响应
接种寄生疫霉菌后，柑橘树皮中CcDof基因的转录水平发生显著变化。其中，CcDof2、CcDof3、CcDof4、CcDof6、CcDof9、CcDof11、CcDof13、CcDof14、CcDof15、CcDof17和CcDof22的表达显著上调，而CcDof10、CcDof16、CcDof19、CcDof23和CcDof24的表达受到抑制。这表明某些CcDof基因可能在柑橘对疫霉菌的防御反应中发挥作用。
3.10. 过表达CcDof4和CcDof6增强柑橘对寄生疫霉菌的抗性
基于表达谱分析，选择了CcDof4、CcDof6和CcDof14进行功能验证。农杆菌介导的瞬时过表达成功提高了这些基因在柑橘叶片中的转录水平。接种疫霉菌后，过表达CcDof4和CcDof6的叶片病害症状严重程度降低，病斑面积显著小于对照。在接种后48小时，CcDof4过表达叶片的平均病斑面积减少了83.7%，CcDof6过表达叶片减少了60.0%。而过表达CcDof14则未改变对疫霉菌的抗性。进一步机制研究表明，CcDof4和CcDof6的过表达激活了水杨酸信号通路标记基因PR1和NPR1的表达。其中，NPR1在CcDof4过表达叶片中诱导更强，而PR1在CcDof6过表达叶片中上调更明显。
4. 讨论
本研究在柑橘中鉴定出的Dof基因数量与甜橙相同，但少于金柑及其他一些物种，这可能反映了进化过程中基因复制模式的差异或受基因组大小的影响。大部分CcDof基因内含子稀少，这种结构特征常与胁迫响应相关，可能有助于其在胁迫条件下被快速调控。启动子中含有丰富的多种响应元件，特别是光响应元件，提示CcDof家族可能广泛参与光信号、激素信号及生物/非生物胁迫响应的调控网络。组织特异性表达和激素诱导表达模式进一步支持了Dof基因在柑橘生长发育和胁迫适应中的功能多样性。低温胁迫和疫霉菌侵染均能显著改变多个CcDof基因的表达，证实了它们参与非生物和生物胁迫响应。功能验证的核心发现是，CcDof4和CcDof6的瞬时过表达能显著增强柑橘对寄生疫霉菌的抗性。这种抗性增强与水杨酸信号通路关键基因NPR1和PR1的上调相关，表明CcDof4和CcDof6可能通过调控SA介导的防御途径来发挥功能。值得注意的是，CcDof4自身的表达也可被SA诱导，这暗示可能存在一个正向反馈调节环路。这些发现为利用Dof转录因子进行柑橘抗病育种提供了重要的候选基因和分子机制见解。
5. 结论
本研究对柑橘Dof转录因子家族进行了全面的基因组学分析，鉴定出24个成员并将其分为六个进化分支。启动子分析和表达谱研究表明，CcDof基因可能广泛参与光响应、激素信号转导及生物/非生物胁迫适应。尤为重要的是，功能分析揭示CcDof4和CcDof6在增强柑橘对寄生疫霉菌抗性中扮演关键角色，其作用机制与激活水杨酸信号通路相关联。综上所述，本研究系统阐述了柑橘CcDof家族的特性，并突出了CcDof4和CcDof6在介导柑橘抗病性中的重要作用，为未来通过遗传工程手段改良柑橘抗病性奠定了坚实的理论基础。
