《Current Issues in Molecular Biology》：Time-Series-Based Co-Expression Network Analysis Reveals Key Regulatory Modules and Hub Genes in Salt-Tolerant Wheat Under Salt Stress
Guiqiang Fan,
Jianan Huang,
Hong-Jin Wang,
Yuxiang Huo,
Peiyu Liu,
Uzair Ullah,
Guohang Hu,
Munib Ahmad,
Abdullah Shalmani and
Tianrong Huang
+ 1 author
编辑推荐：
本文通过时间序列加权基因共表达网络分析，揭示了耐盐小麦品种“小偃22”在盐胁迫下的核心调控模块（黑色模块），其与盐处理和胁迫持续时间显著正相关。研究发现该模块与DNA复制/修复、RNA代谢调控、苯丙素生物合成和角质/木栓质/蜡质合成等功能密切相关，并通过生理指标和基因表达验证，为理解小麦耐盐机制提供了候选靶点与分子育种线索。
引言
盐胁迫是世界范围内限制作物生长和产量的主要非生物胁迫之一。它通过诱导渗透失衡、离子毒害和活性氧（ROS）的过量积累，严重制约小麦的生长和产量。尽管耐盐品种能够通过快速的信号传导和细胞稳态的维持来适应胁迫，但其潜在的动态调控网络仍未被充分解析。本研究重新分析了耐盐小麦品种“小偃22”在盐胁迫下公开可用的时间序列RNA-seq数据（0、1、3、6、12和24小时），并利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建了基于时间序列的共表达网络，旨在从网络层面揭示耐盐小麦对盐胁迫的系统性转录调控框架。
材料与方法
研究重新分析了“小偃22”在盐胁迫下的公开时间序列RNA-seq数据。通过质量控制，使用FPKM表达矩阵构建WGCNA共表达网络。网络构建时考虑了满足无标度拓扑特征的软阈值（power β = 20）。通过动态树切割算法识别共表达模块，并通过合并相似特征基因模块得到最终模块。为分析模块与盐胁迫特征的关系，计算了每个模块的特征基因与性状变量（处理状态treatment_bin和胁迫时间time_h）之间的皮尔逊相关系数。在关键模块内，计算了模块成员（MM）和基因显著性（GS），筛选出枢纽基因。对关键模块基因进行了GO和KEGG通路富集分析。此外，研究还通过测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性以及脯氨酸、可溶性糖、丙二醛（MDA）含量等生理指标，并结合qRT-PCR验证候选基因，为网络推断结果提供了实验支持。
结果
1. RNA-Seq数据质量评估与样本一致性测试
对“小偃22”盐胁迫时间序列转录组表达矩阵的质量评估表明，各样本表达水平分布一致，主成分分析和样本聚类显示，盐处理和胁迫时间是转录组模式差异的主要来源，且生物学重复性高，数据质量稳定可靠，可用于构建高可信度的共表达网络。相关评估结果可参考。
2. 共表达网络构建与关键模块鉴定
WGCNA分析共识别出11个共表达模块，其中黑色模块包含5050个基因，是最大的模块。模块-性状相关性分析显示，黑色模块与盐胁迫处理（r = 0.487）和胁迫持续时间（r = 0.402）均呈显著正相关，被确定为与盐胁迫动态响应密切相关的核心模块。其模块特征基因在盐处理条件下随时间持续升高。相关性热图可参考，模块特征基因的动态轨迹可参考。
3. 关键模块枢纽基因筛选与功能分析
在黑色模块中，基因显著性（GS）与模块成员（MM）呈显著正相关。基于基因与模块特征基因的相关性（kME）筛选出Top 20枢纽基因，其表达模式在盐胁迫下呈现相对一致的动态响应趋势，具有成为关键调控因子的潜力。相关关系与表达模式可参考。
功能富集分析显示，黑色模块中的基因显著富集于DNA复制与基因组合稳定维持、RNA代谢调控、苯丙素代谢以及角质/木栓质/蜡质生物合成等通路。这表明该模块不仅涉及经典的胁迫响应通路，还参与了维持基因组稳定、转录调控能力和构建物理屏障以适应长期胁迫的过程。GO和通路富集分析结果分别参考和。
4. 生理与分子验证
生理指标测定表明，盐胁迫显著增强了“小偃22”的抗氧化防御系统，SOD、POD和CAT活性在胁迫6小时后显著增加，并在24小时维持或进一步升高。同时，脯氨酸和可溶性糖含量显著积累，以缓解渗透胁迫。MDA含量随时间增加，但结合增强的抗氧化酶活性，表明植物可能通过强化抗氧化防御在一定程度上限制了膜损伤。qRT-PCR验证了三个候选枢纽基因在盐胁迫下的显著诱导表达，包括ZAR1样受体激酶、Remorin 4.1和NETWORKED 1D。这些基因的表达模式支持它们在膜信号转导和结构稳态调控中的潜在功能。详细生理与qRT-PCR结果可参考。
讨论与结论
本研究通过整合时间序列转录组、共表达网络分析、生理测定和分子验证，系统揭示了耐盐小麦“小偃22”响应盐胁迫的调控框架。与传统的差异表达基因分析不同，WGCNA方法从模块层面识别出一个随着胁迫进程持续激活的关键黑色模块，体现了盐适应中协调的转录程序。该模块的功能富集提示，长期的盐适应可能涉及对基因组稳定性、转录能力和结构性屏障的协同调控，而不仅仅是激活经典的防御通路。筛选出的枢纽基因，如ZAR1样受体激酶、Remorin和NETWORKED 1D，为理解盐胁迫感知和信号转导提供了新的候选靶点。研究提出一个“膜信号感知—关键模块激活—稳态与结构保护协同”的假说模型，整合了膜信号、细胞稳态维持和物理屏障形成等多个层面，为小麦耐盐性的分子机制解析和分子育种提供了系统的候选基因资源和理论线索。该模型示意图可参考。
