《Infection and Immunity》：The growth and pathogenesis of Citrobacter rodentium are compromised when multiple mucin sugar utilization pathways are disrupted, leading to accumulation of N-acetylglucosamine 6-phosphate
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本研究揭示了肠道病原体利用宿主粘蛋白衍生糖分的代谢脆弱性。研究发现，敲除啮齿柠檬酸杆菌的GlcNAc-6P脱乙酰酶基因nagA会导致胞内GlcNAc-6P积累，干扰GlcN-6P正常合成，从而破坏细胞壁完整性，最终严重削弱细菌在小鼠结肠的定植和致病力。这一代谢瓶颈机制为针对A/E病原体等肠道细菌感染提供了新的潜在治疗策略。
ABSTRACT
许多肠道细菌病原体，包括附着/抹平（A/E）致病性大肠杆菌，可导致人类急性胃肠炎。考虑到哺乳动物胃肠道的高度竞争性，这些病原体必须依赖特定的代谢适应才能成功建立感染。我们假设A/E病原体利用胃肠道粘液中的宿主衍生营养物质，包括N-Z酰葡糖胺（GlcNAc）和N-Z酰神经氨酸（NeuNAc），来助长其致病过程。为验证这一假设，我们通过删除GlcNAc-6-磷酸（GlcNAc-6P）脱乙酰酶编码基因nagA，破坏了小鼠特异性A/E病原体——啮齿柠檬酸杆菌的GlcNAc和NeuNAc代谢通路。与野生型（WT）啮齿柠檬酸杆菌相比，ΔnagA突变株在C57BL/6J小鼠体内的定植和致病力严重减弱。尽管ΔnagA不能分解代谢GlcNAc和NeuNAc，但其体内的缺陷不能仅用营养剥夺来解释。相反，ΔnagA表现出胞内GlcNAc-6P水平升高、体外培养时生长速度减慢、GlcN-6P合成调节改变以及对细胞壁靶向应激源的敏感性增加。补充葡糖胺（GlcN，可直接转化为GlcN-6P）可在不减少GlcNAc-6P积累的情况下，部分恢复ΔnagA的生长和对细胞壁应激的抗性，表明其表型的基础是GlcN-6P合成失调而非GlcNAc-6P毒性。综上，这些数据揭示了啮齿柠檬酸杆菌中一个先前未被认识的代谢脆弱性：通过失活NagA来破坏GlcNAc和NeuNAc代谢通路，会产生一种糖磷酸失衡，从而损害细胞壁完整性和病原体的适应性。因此，靶向糖磷酸应激反应可能为对抗胃肠道细菌病原体提供一种新的治疗策略。
INTRODUCTION
哺乳动物胃肠道内存在一个庞大而多样的微生物群落，它们在稳态条件下与宿主共存。为维持胃肠道健康，杯状细胞——肠上皮细胞的一个特化亚群——合成并顶部分泌粘蛋白，形成一层致密且粘附的粘液屏障，从物理上将管腔微生物与下方的上皮细胞隔开。此粘液屏障主要由凝胶形成的分泌性糖蛋白粘蛋白-2构成，其蛋白骨架富含脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的中心结构域在杯状细胞的高尔基体中进行密集的O-糖基化。这些O-连接聚糖由五种不同的单糖组成：N-Z酰葡糖胺、N-Z酰半乳糖胺、N-Z酰神经氨酸、半乳糖和岩藻糖。虽然粘液作为物理屏障限制了微生物接触宿主组织，但它也在不可渗透的屏障层之上形成了一个营养丰富的栖息地。这个生态位粘液层被一系列共生菌密集定植，它们表达糖苷水解酶以切割粘蛋白聚糖，释放可支持这些粘蛋白溶解菌增殖的自由糖。值得注意的是，这些释放的单糖也可被附近的肠道病原体利用作为营养源，通过支持其在生态位粘液层内的扩增，为其提供超过共生微生物的竞争优势。
近期研究表明，附着/抹平（A/E）病原体，包括肠出血性大肠杆菌和肠致病性大肠杆菌，栖息于肠道粘液层内并最终穿过该层以建立感染。A/E病原体是全球婴儿腹泻和死亡的主要诱因。为定植宿主胃肠道，A/E病原体不仅必须与多样化的常驻微生物群竞争，还必须与占据相同营养生态位的共生大肠杆菌竞争。Bertin等人表明，当暴露于牛小肠内容物时，致病性大肠杆菌菌株EDL933比共生大肠杆菌更有效地消耗了所有五种源自粘蛋白2的单糖，展现了体外竞争性代谢优势。即便如此，病原体利用粘蛋白糖促进其生长的确切机制以及这种相互作用如何影响体内感染动力学仍知之甚少。
对肠致病性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌的直接人体研究不可行，且常规实验室小鼠对这些临床上重要的病原体高度抵抗。因此，啮齿柠檬酸杆菌作为一种天然的A/E小鼠病原体，被广泛用于模拟人类的肠致病性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌感染。为建立感染，啮齿柠檬酸杆菌必须穿过保护性的结肠粘液屏障以到达肠上皮。作为肠杆菌科的一员，啮齿柠檬酸杆菌缺乏某些共生微生物用于降解粘蛋白结合聚糖的糖苷水解酶，这意味着它们无法在完整粘蛋白上生长。Liang等人的近期工作表明，单糖NeuNAc可促进啮齿柠檬酸杆菌的生长，并刺激两种自转运蛋白Pic和EspC的分泌，这两种蛋白增强了啮齿柠檬酸杆菌降解粘液和粘附下方肠上皮细胞的能力，促进其从管腔生态位向粘液相关生态位的转变。无法摄取NeuNAc的啮齿柠檬酸杆菌突变株在小鼠体内显示出显著减弱的定植并引起减弱的病理损伤，突显了NeuNAc利用在致病过程中的重要作用。然而，NeuNAc仅是粘蛋白2聚糖的单糖成分之一，其他丰富糖类（如GlcNAc）的相对贡献仍不明确。值得注意的是，NeuNAc和GlcNAc均通过汇聚到共同中间体GlcNAc-6P的途径进行分解代谢，这表明干扰一条通路可能会影响另一条。这促使我们研究NeuNAc和GlcNAc在啮齿柠檬酸杆菌定植中的作用，重点关注破坏这些代谢途径如何影响病原体在体内的适应性。
RESULTS
C. rodentiumutilizes specific monosaccharides that are abundant in the colonic mucus
在感染小鼠结肠期间，啮齿柠檬酸杆菌最初定植于外层粘液，随后穿过内层粘液屏障层以感染下方的肠上皮细胞，突显了其与结肠粘液的密切关联。Liang等人的先前工作表明，啮齿柠檬酸杆菌可以在粘蛋白衍生糖NeuNAc上生长，但不能在完整粘蛋白上生长。基于此工作，我们检测了啮齿柠檬酸杆菌是否能利用其他粘蛋白衍生糖。我们在补充了粘蛋白2 O-聚糖中五种主要单糖各自的极限培养基中培养野生型啮齿柠檬酸杆菌。如图所示，啮齿柠檬酸杆菌在GlcNAc和NeuNAc上生长旺盛，在半乳糖上次之，但在N-Z酰半乳糖胺或岩藻糖上无法生长。这些结果表明，啮齿柠檬酸杆菌可以利用一部分粘蛋白衍生糖进行生长，特别是GlcNAc和NeuNAc，它们似乎是优选的碳源。
我们接下来测试了GlcNAc和NeuNAc是否存在于小鼠结肠内并可被啮齿柠檬酸杆菌利用。为此，我们选择了C57BL/6J小鼠，因为它们已被证明比其他C57BL/6亚系更容易感染啮齿柠檬酸杆菌。为检测GlcNAc和NeuNAc的空间分布，我们用荧光标记的凝集素染色了C57BL/6J小鼠的结肠组织切片：优先结合GlcNAc的小麦胚芽凝集素，以及对α-2,6连接的NeuNAc有亲和力的接骨木凝集素。WGA染色显示杯状细胞胞质内广泛的信号，以及衬于上皮表面的整个粘液层中的强烈标记。相比之下，SNA染色显得更呈点状，并富集在杯状细胞的顶表面和外层粘液层。虽然两种凝集素都标记了杯状细胞和上覆的粘液，但它们不同的模式表明GlcNAc和NeuNAc在粘液屏障内的定位存在差异，这与先前在小鼠结肠组织中使用WGA和SNA染色的报告一致。
为了更精确地定量GlcNAc和NeuNAc，我们使用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测量了小鼠粪便样本中的水平。由于这些糖可能源自多种来源，包括外源性食物和宿主糖蛋白，我们试图确定它们是否主要来源于分泌的粘蛋白。为此，我们比较了野生型小鼠与缺失主要凝胶形成粘蛋白粘蛋白2的粘蛋白2敲除小鼠的粪便。从粘蛋白2野生型小鼠收集的粪便中，GlcNAc和NeuNAc的水平显著高于粘蛋白2敲除小鼠，支持了这些糖主要来源于粘蛋白2的结论。
我们接下来评估了啮齿柠檬酸杆菌感染是否改变了这些糖的丰度。对感染的C57BL/6J小鼠粪便样本的糖定量显示，GlcNAc和NeuNAc在整个感染过程中持续可检测，表明它们作为潜在营养物质的可用性。与基线相比，GlcNAc水平在感染后第3天显著增加，表明啮齿柠檬酸杆菌感染可能增强了GlcNAc从粘蛋白聚糖中的释放。总之，这些发现证实了GlcNAc和NeuNAc在空间上富集于粘液层，在整个感染期间持续存在，并且可供啮齿柠檬酸杆菌进行代谢利用。
Inactivation of the GlcNAc and NeuNAc catabolic pathway impairs C. rodentiumcolonization in mice
NeuNAc和GlcNAc的分解代谢途径在多种微生物中紧密相连，NeuNAc的分解直接汇入GlcNAc途径。具体而言，NeuNAc首先被裂解为N-Z酰甘露糖胺，然后转化为GlcNAc-6P，这与细胞外GlcNAc通过磷酸转移酶系统吸收时产生的中间体相同。在细菌细胞质中，NagA进一步将GlcNAc-6P脱乙酰化形成葡糖胺-6-磷酸，这是糖酵解和肽聚糖合成的前体。
为研究GlcNAc和NeuNAc分解代谢在啮齿柠檬酸杆菌定植中的作用，我们构建了一个突变菌株ΔnagA，其缺乏将GlcNAc-6P转化为GlcN-6P所需的NagA酶。我们用WT或ΔnagA啮齿柠檬酸杆菌菌株感染C57BL/6J小鼠，并在感染后第1、2、4和6天监测粪便颗粒中的病原体排出情况，随后在第8天收集盲肠和结肠组织。WT和ΔnagA感染的小鼠在感染后第1和第2天表现出相似的较低病原体负荷，每克粪便中携带约106菌落形成单位。随着感染进展，WT在第6天时强劲扩增到109CFU，而ΔnagA保持在低100-1000倍的水平。这种定植差异持续到感染后第8天，此时WT啮齿柠檬酸杆菌在粪便、盲肠和结肠组织中的CFU显著高于ΔnagA突变菌株。
组织学分析显示，ΔnagA感染的小鼠比WT感染的小鼠产生了更温和的炎症反应。虽然WT感染导致广泛的上皮损伤、免疫细胞浸润和隐窝增生，但ΔnagA菌株的感染仅导致有限的上皮细胞破坏和减少的免疫浸润。这些结果表明，ΔnagA菌株在定植和诱导结肠病理组织损伤方面的能力受损。
The attenuated phenotype of ΔnagA is driven by GlcNAc-6P accumulation rather than nutrient limitation
如前所述，先前的研究报告了鼠伤寒沙门菌和霍氏肠杆菌在删除nagA后出现严重的定植缺陷，这归因于它们无法利用GlcNAc和NeuNAc作为营养物质。为探究这是否是ΔnagA啮齿柠檬酸杆菌观察到的定植缺陷的基础，我们构建了一个不能将GlcNAc和NeuNAc转运到细胞质中的突变菌株。这个缺失了ManXYZ、NagE和NanT转运蛋白的突变体被命名为Δmana。为排除nagA删除可能产生的非预期极性效应，我们还构建了ΔnagA/pNagA回补菌株，其中ΔnagA突变体被转化了表达其天然启动子控制下的NagA的质粒pZA31MCS。将WT、ΔnagA、ΔnagA/pNagA和Δmana在同时补充了GlcNAc和NeuNAc作为碳源的极限培养基中培养。WT和ΔnagA/pNagA菌株表现出相似的生长速率，而Δmana和ΔnagA未能增殖。
为检验ΔnagA的代谢缺陷是否可以在含有丰富替代碳源（如葡萄糖和氨基糖）的营养丰富条件中被挽救，我们在LB培养基中培养了所有菌株。令人惊讶的是，ΔnagA表现出明显的生长延迟，并且未能达到与WT、Δmana或ΔnagA/pNagA菌株相同的最终光密度。补充GlcNAc进一步加剧了这种生长延迟，但有趣的是，补充GlcN可以部分挽救它。GlcN是一种可被ManXYZ（一种对包括GlcNAc和GlcN在内的多种糖具有广谱特异性的PTS转运蛋白）转运的碳源，并汇入GlcNAc/NeuNAc分解代谢途径，从而绕过了对NagA的需求。值得注意的是，尽管ΔnagA和Δmana都不能分解代谢GlcNAc和NeuNAc，但ΔnagA在LB中表现出生长延迟，而Δmana没有，这表明仅营养可用性受损不足以解释生长缺陷。ΔnagA和Δmana之间的这种表型差异，两者在利用GlcNAc和NeuNAc作为碳源方面存在相同的缺陷，暗示了细胞内代谢处理的差异可能是ΔnagA表型的基础。
因此，我们检测了GlcNAc/NeuNAc代谢途径，以找出两种突变菌株之间的区别特征。Δmana不能将GlcNAc或NeuNAc导入细胞质，而ΔnagA保留了完整的转运系统但不能将GlcNAc-6P转化为GlcN-6P，导致代谢流在GlcNAc-6P处停滞。基于这些通路差异，我们假设ΔnagA可能在细胞内积累GlcNAc-6P。为确定改变的代谢物水平是否伴随着观察到的生长表型，我们在生长测定中使用的相同LB条件下，使用Morgan-Elson法量化了细胞内GlcNAc-6P水平。这种比色法通过碱性硼酸盐反应检测N-Z酰己糖胺，随后用Ehrlich试剂产生在585nm处可测量的显色产物。尽管无法区分游离GlcNAc和GlcNAc-6P，但测量到的信号仍主要反映细胞内GlcNAc-6P水平，因为外源性导入的GlcNAc在细胞质中总是被磷酸化。当在补充了GlcNAc的LB中生长时，ΔnagA积累的GlcNAc-6P显著高于WT啮齿柠檬酸杆菌，而ΔnagA/pNagA和Δmana的水平与WT相当。我们接下来在补充了葡萄糖和GlcNAc作为碳源的极限培养基条件下量化了GlcNAc-6P水平，这提供了一个变化较小的代谢背景。ΔnagA再次积累了显著高于WT的GlcNAc-6P水平。值得注意的是，在LB或极限培养基条件下，补充GlcN并未改变ΔnagA的GlcNAc-6P水平。
在观察到GlcNAc-6P在ΔnagA突变体中积累后，我们接下来评估了GlcNAc-6P积累是否产生细胞毒性效应并降低细菌活力。将WT、ΔnagA、Δmana和ΔnagA/pNagA啮齿柠檬酸杆菌菌株在补充了0.1% GlcNAc的PBS中培养18小时，并在培养前后计数CFU。WT和ΔnagA/pNagA菌株在培养期间显示出适度的、但无统计学显著意义的CFU增加，表明在这些条件下没有活力损失。更重要的是，在ΔnagA中未观察到显著的活力下降，这与Δmana相似，表明GlcNAc-6P积累不会直接降低ΔnagA的存活率。
总之，这些数据表明，ΔnagA在营养丰富和极限生长条件下均积累了升高的细胞内GlcNAc-6P水平，这将其与Δmana和回补菌株区分开来。即使在改善ΔnagA生长的条件下，GlcNAc-6P积累的持续存在表明，存在一种尚未明确的机制驱动其表型。
GlcNAc-6P accumulation disrupts normal GlcN-6P synthesis in ΔnagA, leading to compromised cell wall integrity
我们接下来评估了ΔnagA中的GlcNAc-6P积累是否与GlcNAc和NeuNAc分解代谢途径内基因表达的变化相关。在之前的测定中观察到，添加GlcN可部分恢复ΔnagA的生长。由于GlcN被ManXYZ磷酸转移酶系统转运，该系统介导多种糖的摄取，包括GlcNAc和GlcN，我们研究了负责GlcN-6P合成和周转的基因。值得注意的是，虽然ΔnagA保留了ManXYZ并可以获得外源性GlcN-6P，但Δmana菌株缺乏此转运蛋白，仅依赖通过氨基转移酶GlmS从果糖-6-磷酸内源性产生GlcN-6P，其作用被脱氨酶NagB逆转。使用实时定量PCR，我们量化了在补充了GlcNAc的极限培养基中生长的啮齿柠檬酸杆菌glmS和nagB的转录水平。能够从外源性GlcNAc产生GlcN-6P的WT和ΔnagA/pNagA，与ΔnagA和Δmana相比，显示出显著更低的glmS表达水平。相比之下，由于无法摄取或分解代谢外源性GlcNAc，ΔnagA和Δmana增加了GlmS酶的转录水平以从内源性果糖-6-磷酸产生GlcN-6P。然而，观察到ΔnagA与其他三个菌株相比也显著上调了nagB。先前在大肠杆菌中的研究表明，GlcNAc-6P积累会使nag操纵子阻遏物NagC失活，导致nagA和nagB的去阻遏。与大肠杆菌中的发现一致，这些结果突显了啮齿柠檬酸杆菌ΔnagA面临的调控困境：GlcNAc-6P积累但无法脱乙酰化为GlcN-6P，使得nagB持续活跃，从而阻碍了GlcN-6P的合成。相比之下，Δmana不积累GlcNAc-6P，因此避免了在ΔnagA中观察到的转录失调，并且可以从果糖-6-磷酸正常合成GlcN-6P。总之，这些结果表明，ΔnagA中的GlcNAc-6P积累导致nagB基因表达上调。
GlcN-6P是肽聚糖合成必需的前体。我们接下来评估了受损的GlcN-6P合成是否会影响啮齿柠檬酸杆菌细胞壁的完整性。溶菌酶是哺乳动物胃肠道中发现的一种先天性抗菌酶，可水解肽聚糖主链中的β-1,4-糖苷键，从而损害细菌细胞壁完整性。为评估GlcNAc-6P积累是否使啮齿柠檬酸杆菌对溶菌酶更敏感，我们在存在GlcNAc或GlcN的情况下，将我们的啮齿柠檬酸杆菌菌株暴露于10mg/mL溶菌酶。观察到在存在GlcNAc的情况下，ΔnagA对溶菌酶攻击更敏感，而当添加GlcN时，这种敏感性降低。这与我们先前的发现一致，即GlcN补充允许ΔnagA绕过NagA并以GlcN-6P进入通路，从而缓解GlcNAc-6P积累的负面影响并恢复细胞壁合成。此外，ΔnagA在高NaCl浓度下表现出活力下降，表明被破坏的GlcN-6P合成可导致对渗透应激的高度敏感性。添加GlcN将此表型恢复到WT水平，突显了直接补充GlcN-6P绕过了NagA依赖的步骤并挽救了ΔnagA的缺陷。
抗生素敏感性分析进一步支持了这种细胞壁缺陷。ΔnagA被证明对万古霉素（一种通过结合肽聚糖前体的D-Ala-D-Ala末端来阻断交联的靶向细菌细胞壁的糖肽）更易感。类似地，补充GlcN导致ΔnagA在万古霉素暴露下的生长有适度改善。相比之下，ΔnagA对四环素（一种靶向核糖体、抑制蛋白质合成而不直接影响肽聚糖的抗生素）的敏感性与其他三个菌株保持相似，GlcN补充在该测定中未显著改变菌株的反应。这些结果共同表明，GlcNAc-6P积累通过耗尽GlcN-6P库来破坏细胞壁完整性，为在啮齿柠檬酸杆菌ΔnagA菌株中观察到的减弱的定植提供了机制性解释。总之，GlcNAc-6P积累损害了GlcN-6P的生物合成，破坏了肽聚糖稳态，并使ΔnagA对细胞壁应激源敏感。
Deletion of GlcNAc/NeuNAc import rescues ΔnagA attenuation during mouse infection
ΔnagA啮齿柠檬酸杆菌在定植C57BL/6J小鼠肠道方面的缺陷，可能是由于胞质GlcNAc-6P的积累和/或可用营养物质（GlcNAc和NeuNAc）的不足。为区分这两种可能性，我们用Δmana菌株感染了C57BL/6J小鼠。Δmana感染的小鼠保持了高粪便负荷和组织细菌载量，与WT相当，表明在单菌株条件下，仅失去GlcNAc/NeuNAc摄取能力本身并不显著损害啮齿柠檬酸杆菌感染小鼠的能力。然而，在竞争性感染测定中，WT显著胜过Δmana，证明在体内感染期间，
