《Genes》：SINEUP-Mediated Overexpression of Endogenous α-Amylase as a Therapeutic Approach in Lafora Disease
Lorenzo Allegri,
Federica Baldan,
Catia Mio,
Valentina Imperatore,
Cinzia Costa,
Paolo Prontera,
Francesca Bisulli,
Lorenzo Muccioli and
Giuseppe Damante
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本研究提出一种基于SINEUP非编码RNA技术的新策略，旨在通过转录后上调患者内源性胰腺α-淀粉酶(AMY2A)蛋白水平，从而降解致病性聚葡萄糖包涵体（Lafora bodies， LBs），以治疗由糖原代谢异常导致的Lafora病。实验证明该策略在患者来源的成纤维细胞中可有效降低细胞内糖原含量，为该疾病的基因治疗提供了概念验证。
1. 引言
Lafora病是一种极为罕见、进展迅速、常染色体隐性遗传的神经退行性疾病，属于进行性肌阵挛性癫痫。其病理核心在于糖原代谢异常，导致异常、不可溶的聚葡萄糖包涵体，即Lafora小体，在多种组织中积累，尤其是在中枢神经系统内，从而引发神经炎症和神经元退行性变。目前，该病尚无疾病修饰疗法，主要依赖于症状控制。
致病基因为EPM2A（编码laforin蛋白）或NHLRC1（编码malin蛋白）。这两个基因编码的蛋白质协同作用，构成一个糖原质量控制系统。当糖原结构异常时，laforin可结合并招募malin，从而限制异常糖原合成并促进其降解。该系统的失活导致异常、过度磷酸化的糖原积累，最终形成Lafora小体。鉴于LBs在疾病中的核心作用，旨在减少或清除这些包涵体的治疗策略备受关注。
近年来，有研究探索使用能够穿透细胞膜并递送人胰腺α-淀粉酶的抗体-酶融合蛋白来在体内降解LBs。这些发现支持基于胰腺α-淀粉酶的方法是缓解LD病理的一种有前景的策略。
SINEUPs是一类新近发现的反义长链非编码RNA，以其能够增强靶信使RNA翻译的能力而闻名。其分子结构包含一个识别靶mRNA特异性序列的反义结合域，以及一个可增强翻译的效应域。已有证据表明，SINEUP技术可有效诱导目标基因的内源性过表达，部分规避了外源过表达机制的相关问题。
基于以上背景，本研究旨在探讨利用SINEUP作为一种创新治疗策略，在体外上调人胰腺α-淀粉酶以触发LBs降解的潜力。
2. 材料与方法
本研究使用了来自一名携带NHLRC1基因c.386C>A; p.Pro129His突变的Lafora病患者的成纤维细胞系，以及三种中枢神经系统来源的肿瘤细胞系。设计并合成了两种靶向人胰腺α-淀粉酶mRNA的SINEUP分子，并将其转染至上述细胞系中。通过Western blot检测α-淀粉酶蛋白水平，通过实时定量PCR检测mRNA水平，并使用比色法检测α-淀粉酶的酶活性及细胞内糖原含量。此外，还使用了Epm2aR240X突变型Lafora病小鼠模型，检测了其不同脑区（皮层、小脑、纹状体、海马）和胰腺组织中α-淀粉酶的蛋白表达。
3. 结果
3.1. 胰腺α-淀粉酶在连续细胞系中的基础表达
首先评估了胰腺α-淀粉酶基因在不同细胞系中的表达水平。结果表明，来源于Lafora病患者的GM08935成纤维细胞表达的AMY2A mRNA水平显著高于中枢神经系统来源的肿瘤细胞系。Western blot分析进一步证实，GM08935细胞的α-淀粉酶蛋白基础表达水平也最高。
3.2. AMY2A特异性SINEUP在CNS来源肿瘤细胞和LD成纤维细胞中的效果
设计了两种靶向人淀粉酶mRNA的SINEUP。在Lafora病患者来源的GM08935细胞中，转染两种SINEUP均能显著提高α-淀粉酶蛋白水平，其中SINEUP 2效果更强，可使蛋白水平增加约4倍。而在三种中枢神经系统来源的肿瘤细胞系中，虽然也观察到了蛋白水平升高的趋势，但实验间存在较大变异性，未达到统计学显著性。
3.3. SINEUP转染后的淀粉酶酶活性
为验证蛋白水平增加是否伴随功能增强，检测了细胞内α-淀粉酶的酶活性。在GM08935细胞中，SINEUP处理诱导了淀粉酶酶活性的显著增加，SINEUP 1和SINEUP 2分别使酶活性增加了约2倍和6倍。在其他细胞系中也观察到了酶活性增强的趋势，但由于高变异性，未达到统计学显著性。
3.4. 细胞内糖原含量的定量
在证明了α-淀粉酶蛋白水平和酶活性增加后，检测了SINEUP处理对细胞内糖原含量的影响。结果显示，在GM08935细胞中，两种靶向α-淀粉酶的SINEUP处理均导致细胞内糖原含量显著降低。尽管在其他细胞系中也观察到了糖原水平降低的趋势，但高变异性使得这种降低仅在CCF-STTG1细胞经SINEUP 2处理后达到了统计学显著性。
3.5. 胰腺α-淀粉酶在小鼠组织中的表达
Western blot分析显示，在3月龄的laforin敲入小鼠胰腺中检测到高水平的α-淀粉酶表达。在所有检测的脑区，包括皮层、小脑、纹状体和海马，也观察到了较低但明确可检测的酶水平。密度定量分析证实了α-淀粉酶在整个中枢神经系统中的存在，表明该小鼠模型的中枢神经组织表达可测量的α-淀粉酶。
4. 讨论
本研究证实，利用SINEUP技术上调内源性胰腺α-淀粉酶表达是一种可行的策略，并在Lafora病患者来源的成纤维细胞模型中展现出功能有效性。SINEUP处理成功增加了α-淀粉酶蛋白水平，增强了其酶活性，并显著降低了细胞内糖原含量。尽管尚不能完全确定观察到的糖原减少是源于Lafora小体的降解还是其他细胞内聚葡萄糖的降解，但这结果证明了该策略具有功能性影响。
然而，在基础α-淀粉酶表达水平较低的中枢神经系统来源肿瘤细胞系中，SINEUP的效果不一致且变异性大，这表明SINEUP的活性需要靶mRNA具备最低限度的基础表达水平。针对鼠源淀粉酶设计的SINEUP在鼠星形胶质细胞系中未检测到效果，也支持了这一观点。尽管如此，在laforin敲入小鼠脑组织中检测到内源性α-淀粉酶表达，为未来在动物模型中测试鼠源淀粉酶特异性SINEUP提供了依据。
总之，这项研究为SINEUP介导的胰腺α-淀粉酶上调作为Lafora病潜在治疗策略提供了概念验证。通过进一步优化和在相关体内模型中进行验证，该方法可能为开发靶向Lafora病中病理性糖原积累的新型干预措施做出贡献。
