《Genes》：DNA Fragmentation Analysis in Human Sperm—Technical Instructions to Prevent False Positives and Negatives in Angle-Modulated Two-Dimensional Single-Cell Pulsed-Field Gel Electrophoresis
Satoru Kaneko,
Yukako Kuroda and
Yuki Okada
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本文系统评述了人类精子DNA片段化分析技术，重点介绍了其自主研发的单细胞脉冲场凝胶电泳（SCPFGE）方法，包括一维（1D）和角度调制二维（2D）技术。文章指出传统方法（如彗星试验、精子染色质结构分析等）因技术原理所限，在检测早期自然发生的DNA片段化时存在灵敏度不足、易受核蛋白干扰、易产生假阴性/阳性结果等问题。作者详细阐述了为确保SCPFGE定量性能而开发的关键技术环节，如抗活性氧（ROS）系统、凝胶内同时肿胀与酶解、角度旋转电泳、低温液体储存、抗氧化电泳缓冲液等，旨在为临床辅助生殖技术（ART）中的精子DNA完整性评估提供更准确、可靠的分析方案。
在过去二十年中，大量研究利用彗星试验（CA）、精子染色质结构分析（SCSA）、精子染色质分散试验和TUNEL试验等方法，探讨了人类精子DNA片段化的病因学意义。为了检测自然发生的DNA片段化的早期迹象，研究者开发了单细胞脉冲场凝胶电泳技术，包括一维（1D-SCPFGE）和角度调制二维（2D-SCPFGE）方法。通过使用经过纯化的、有或无DNA片段化的人类精子进行的比较研究表明，传统方法存在一些技术局限。本技术综述概述了确保SCPFGE定量性能的操作流程。
1. 引言
每个个体出生时都带有一些新的遗传变异，称为从头突变，这些突变发生在配子形成或胚胎发生过程中。DNA修复和凋亡机制能有效清除受损的生殖细胞，但这些清除能力在精子发生后期下降，导致DNA损伤在精子中积累。精子中的DNA损伤已被实验证明会导致下一代胚胎发育缺陷和先天性异常，除非在受精后被母体因子修复。由于缺乏同源模板，合子对父源双链断裂（DSBs）的修复依赖于非同源修复机制，这被认为是容易出错的。这很大程度上解释了为什么子代中的大多数从头突变（包括拷贝数变异）源自父方。在体细胞中，单链断裂（SSBs）是最常见的DNA损伤，每个细胞每天发生数万次。碱基切除修复是修复有害DNA损伤（包括非庞大DNA加合物、脱嘌呤/脱嘧啶（AP）位点和SSBs）的主要途径。如果这些损伤未被修复或修复错误，它们可能在DNA复制过程中转变为DSBs，从而威胁遗传完整性。DSBs是最难修复的DNA损伤，并且细胞核中DSBs的临界数量可能非常低。DSBs的数量与有害DNA损伤的发生并不直接相关，因为超过临界阈值可能导致受精失败或流产。检测DNA片段化的早期迹象对于临床辅助生殖技术（ART）的诊断应用至关重要。鉴于它们的相对频率，单核DSBs和SSBs（包括AP位点）最好一起分析。
无数研究考察了DNA损伤对受精、植入后胚胎发育以及ART中精子源性先天异常的影响。在过去的二十年中，人们使用各种检测方法（如CA、SCSA、精子染色质分散试验和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记试验）研究了人类精子中非特异性的单核DNA损伤。研究者制备了有或无DNA片段化的人类精子并分析了它们的细胞特性。使用这两个极端样本进行的比较研究表明，由于技术限制，上述方法未能通过定性验证的初步步骤。
传统的潜式凝胶电泳（SGE）用于CA，通过计算从原点（称为彗星尾）释放的颗粒状片段的数量来评估DNA损伤水平。研究者开发了一维单细胞脉冲场凝胶电泳（1D-SCPFGE）来克服SGE的局限性。凝胶内酶解后的DNA团块从原点释放出长链纤维，纤维状和颗粒状片段在这些纤维的尖端之外分离。后来，研究者引入了新的角度调制二维单细胞脉冲场凝胶电泳（2D-SCPFGE）。在150度旋转后继续进行电泳，长链纤维意外地从原点以一定角度向后延伸，并且纤维状片段从在第一次电泳期间延伸的一束长链纤维中被拉出。即使使用脉冲场凝胶电泳，仅采用单向电流有时也会导致DNA片段化分析出现假阴性。
研究者开发了以下技术能力以减少假阳性和假阴性：（1）从人类精液中纯化无DNA片段化的活动精子和具有终末阶段片段化的不活动精子，用作比较标准和测试对象；（2）在非水溶剂中进行低温液体储存以保持DNA序列的完整性；（3）将精子铺展并粘附到玻片上；（4）将精子包埋在薄琼脂糖膜中；（5）紧密包装的细胞核在凝胶内肿胀；（6）核蛋白在凝胶内酶解以制备裸露的DNA纤维；（7）设计具有三个电极对的圆形电泳槽；（8）制备抗氧化电泳缓冲液；（9）开发角度调制2D-SCPFGE用于从完整纤维中分离长纤维状片段；（10）单核裸露DNA纤维的二维排列；（11）创建电泳后荧光染色和抗DNA片段化添加剂，以在蓝光激发期间保护DNA序列；以及（12）处理感兴趣区域（ROI）的图像。
尽管2D-SCPFGE是作为DNA片段化分析工具开发的，但角度旋转提供了单核DNA纤维的各种二维排列，这也为DNA科学的广阔领域开辟了新视野。
2. 宏观和微观PFGE中的DNA观察
琼脂糖可用于制造由氢键连接的多糖链束组成的大孔热塑性凝胶。具有单向电流的SGE是用于DNA分析的最常见的宏观凝胶电泳形式。其主要步骤包括细胞团块的酶解、随后的去蛋白化（例如使用含玻璃纤维过滤器的离心柱）以及裸露DNA在数厘米凝胶中的迁移。由于DNA中的磷酸盐离子完全解离，带负电的DNA向阳极移动，移动速率与DNA大小成反比，与电泳缓冲液的pH值无关。缓冲液的组成和离子强度以及电压-电流特性影响DNA的电泳行为。同时运行已知的DNA大小标记物有助于比较，从而根据其电泳迁移率确定DNA片段的碱基对大小。
宏观PFGE由Schwartz和Cantor于1984年开发，允许测定高达10 Mb的DNA片段大小。凝胶尺寸与正常SGE中使用的相似；然而，宏观PFGE的关键特征是电压方向周期性反转，导致大DNA分子以锯齿形模式穿过琼脂糖孔。由于长DNA非常脆弱且易于剪切，将纯培养的原核生物总量包埋在琼脂糖塞中，然后进行酶解。此外，使用限制性内切酶进行电泳前缩小尺寸对于原核DNA片段在宏观PFGE中有效迁移是必要的。目前，细菌DNA指纹图谱是宏观PFGE的主要应用，而其用于真核生物的应用仅限于酵母。
单细胞微观PFGE与上述两种宏观方法有显著不同。测试对象是游离细胞或从真核生物分散的细胞。这些细胞要么悬浮在熔化的琼脂糖中以在玻片上形成薄膜，要么通过自动离心涂片铺展在玻片上，然后包埋在琼脂糖中制成薄膜。凝胶内酶解后，完整的染色体DNA和各种大小的片段的混合物不经限制性内切酶切割即进行电泳。电泳图谱通过荧光显微镜观察。
3. DNA片段化分析比较标准的制备
研究者先前制备了无DNA片段化的人类活动精子和具有终末阶段DNA片段化的不活动精子，作为DNA片段化分析的比较标准。在临床ART中，前者可用于体外受精以及卵胞浆内单精子注射（ICSI）。
3.1. OptiPrep中的平衡沉降
按照世界卫生组织参考手册评估精子浓度和活力。用20 mmol/L HEPES缓冲的Hanks溶液（pH 7.4；下称“Hanks”）将精液样本稀释三倍。使用20 mmol/L HEPES-NaOH（pH 7.4）、Hanks粉末和2.0 mg/mL人血清白蛋白制备等渗的OptiPrep密度梯度培养基（密度：1.17 g/mL；下称“OP”）。将悬浮液加在0.5 mL OP上，以600× g离心10分钟。沉淀和界面层重悬至1.0 mL。将其加在0.5 mL OP上，以10,000× g超速离心10分钟，以分离界面层和沉淀。
3.2. Percoll中的差速沉降
分离界面层和沉淀，用Hanks稀释多次，并在90% Percoll密度梯度中离心。90% Percoll用20 mmol/L HEPES-NaOH（pH 7.4）、Hanks粉末和2.0 mg/mL人血清白蛋白制成等渗（密度：1.12 g/mL；下称“Percoll”）。然后将5.0 mL Percoll置于15 mL锥形试管中，加入1.0 mL Hanks。轻轻混合该混合物，以30度角旋转10次形成线性密度梯度。将精子悬浮液加在梯度上，用水平转子以400× g离心30分钟。从OP的界面层或Percoll沉淀中收集无DNA片段化的活动精子。将1.0 mL Hanks加在Percoll沉淀（0.2 mL）上，室温孵育60分钟。回收到游至上Hanks层一半的精子。从OP的沉淀或中间Percoll层获得具有晚期DNA片段化的不活动精子。活动精子称为“纯化精子”（PS），不活动精子称为“变性精子”（DS）。这两组在细胞特征上存在显著差异，分别反映了尚未发生凋亡的精子和已经发生凋亡和变性的精子。PS是从大约十几个精液样本中制备的；通过1D-SCPFGE确定的DNA片段化率最低的样本被用作标准。DS是从相同的精液样本中制备的。PS和DS均储存在低温保存培养基中。
4. 从传统分析方法中获得的经验教训
在新开发的分析方法用于临床诊断之前，必须使用比较标准通过多个验证步骤。传统的DNA损伤分析由于其基本原理和技术限制，无法满足定量验证的初步步骤。图1说明了1D-和2D-SCPFGE的开发过程。本节解释SCSA和CA存在的问题。
4.1. SCSA忽视了核蛋白的干扰
SCSA采用简单的二分原理，其中单体吖啶橙（AO）插入双链DNA或寡聚AO吸附到单链DNA分别产生绿色或红色荧光。几项实验表明，AO无法检测人类精子中的DNA损伤：在显微镜下或通过流式细胞术，AO染色无法区分PS和DS；淋巴细胞的细胞核和细胞质分别发出绿色和红色荧光；凝胶内胰蛋白酶消化去除了红色荧光。这些现象表明，绿色荧光来自插入的AO，而红色荧光来自吸附在核蛋白上而非单链DNA上的AO。DNA荧光探针通常与除DNA外的各种细胞内物质相互作用，而SCSA没有考虑核蛋白的干扰，这强调了使用PS和DS进行定量验证的重要性。
SCSA的一个技术问题是使用未分离的人类精液作为测试样本。即使在正常精子症中，精液样本中超过一半的精子已经变性，显示出终末阶段片段化。如第3节所述，PS是临床ART中更可取的替代方案。DNA损伤分析的目标是检测分离后的PS中的早期迹象；未分离的精液不符合资格。
4.2. 缺乏凝胶内酶解和SCPFGE损害了中性和碱性CA的灵敏度
在中性CA中，使用高盐提取核蛋白和传统的SGE，并通过计算颗粒状片段（彗星尾）的数量来评估DNA损伤水平。高盐提取从DS中释放出颗粒状片段，但未能从PS中拉伸出长链纤维。1D-SCPFGE从凝胶内酶解的PS中拉伸出长链纤维。DS的凝胶内酶解导致颗粒状片段急剧增加。1D-SCPFGE追踪人类精子中的DNA片段化；最初，在延伸的长链纤维束的前端之外出现少量大的纤维状片段，该过程持续进行，直到几乎所有DNA纤维都被撕碎成颗粒状片段。中性CA只能用于检测片段化的最后阶段。
人类精子核蛋白由鱼精蛋白、组蛋白、凝缩蛋白和黏连蛋白组成。DNA-核蛋白复合物通过核基质附着在核膜上。虽然高盐溶液通常用于提取鱼精蛋白，但一些核蛋白仍然附着在完整的DNA纤维和片段上。只有一部分颗粒状片段脱离附着并作为彗星尾释放。PS和DS之间的比较实验突出了凝胶内酶解和SCPFGE的重要性，因为SCSA和中性CA都没有考虑核蛋白干扰，并且只有裸露的DNA才能通过电泳分析。
碱不稳定性位点（ALSs），例如AP位点，在高pH下导致DNA链断裂。碱性CA中，DNA用300 mmol/L NaOH处理，在SSBs和ALSs处诱导DSBs。基于碱的SSB检测有高估损伤的风险。当PS用30 mmol/L NaOH处理时，具有凝胶内酶解的1D-SCPFGE显示比具有高盐提取和SGE的中性CA释放更多的颗粒状片段。一些核蛋白抵抗高碱度，通过碱水解保持附着在新的颗粒状片段上，这可能会阻碍它们的电泳迁移。缺乏凝胶内酶解可能导致中性和碱性CA出现假阴性结果。由于篇幅限制，本综述重点介绍了SCSA、CA、精子染色质分散试验和TUNEL试验的技术局限性。它们强调了使用比较标准、校准曲线、适当的灵敏度和测试对象的资格标准来验证该领域分析方法的定量性能的重要性。
5. 1D-和2D-SCPFGE的技术规范
1D-和2D-SCPFGE的操作程序相似。唯一区别是后者在初始电泳后涉及一次或多次角度旋转。本节概述SCPFGE的技术规范。
5.1. 琼脂糖膜对玻璃表面的粘附
对于琼脂糖粘附，研究者使用了市售的MAS涂层玻片，通过化学表面修饰引入氨基残基，以防止组织切片从玻片上脱落。用于包埋的琼脂糖在酸性pH下与玻片结合。如第5.3节所述，研究者将用于包埋的琼脂糖的pH从4.7（乙酸缓冲液）改为9.0（Na2CO3-NaHCO3）。虽然琼脂糖在酸性pH下通过氢键与离子化的氨基残基相互作用，但在pH 9.0时它不与非离子残基相互作用。
玻片表面（2.5 × 6.0 cm面积）涂有30 μL 1.0%低熔点琼脂糖（琼脂糖GB；熔化温度约80 °C，凝固温度约25 °C）。一旦脱水，琼脂糖牢固地附着在玻璃表面，用于包埋的琼脂糖通过羟基-羟基氢键粘附。
5.2. SCPFGE设备
图2显示了用于2D-SCPFGE的圆形电泳槽示意图，具有间隔45度的三对电极。设备应放置在稳定、水平的表面上。五个带有凝胶膜的玻片垂直堆叠在带有旋转枢轴的架子上。包埋的DNA应精确放置在三个电流交点的枢轴上。电泳在恒定电压（3.5 V/cm）下进行，切换间隔为4.0秒，顺序为：左、中、右，然后反向。研究者开发了内部时间切换控制器。电泳缓冲液至少深4厘米以浸没所有五个玻片。设计了弱有机电解质的组合以防止电源过流。图2中的高倍图像显示了长链纤维的S形轨迹。该形状根据电压、切换间隔、缓冲液的离子强度和琼脂糖的孔径而变化。
5.3. 凝胶内同时肿胀与酶解
具有凝胶内酶解的1D-SCPFGE导致延伸的长链纤维和片段呈线性排列。SCPFGE的先前方案在包埋后立即凝固琼脂糖以防止凝胶内酶解，紧密包装的DNA团块保持为小而亮的核心。研究者开发了2D-SCPFGE-0-150（6/4分钟），其中凝胶在第一次电泳后旋转150度。所有先前在延伸的长链纤维尖端之外分离的片段都变成向后倾斜并聚集在200倍放大的CCD相机拍摄范围内。第二次电泳产生了意想不到的结果：额外的长链纤维从原点向后倾斜释放并呈扇形展开。长纤维状片段从延伸的纤维束中被拉出到扇形的内角。明亮的核心仍在原点可见。图3C，D显示了DS的1D-和2D-SCPFGE图谱；几乎所有纤维已经被撕碎成颗粒状片段，在原点没有发现明亮的核。1D-SCPFGE对于观察片段化的晚期和最后阶段具有足够的灵敏度且非常方便。
为了最大化两个方向拉出的长链纤维数量，紧密包装的DNA团块通过凝胶内同时肿胀和酶解而肿胀。人类精子通过离心自动涂片粘附在琼脂糖涂层玻片上。具体来说，将0.5 mL 0.4%琼脂糖GB（含0.1 M Na2CO3-NaHCO3， pH 9.0， 0.02% SDS， 1.0 mmol/L EDTA）在85°C熔化10分钟，然后在42°C即将使用时加入10 μL蛋白酶K（重组，20 mg/mL）、0.5 mol/L DTT（溶于0.1 mol/L乙酸缓冲液，pH 4.7）和1.0 mol/L依达拉奉（溶于DMSO）。取60 μL此溶液置于精子上，并用盖玻片覆盖以获得100 μm厚度。在加湿室中进行凝胶内肿胀（37°C）、冰上冷却（4°C）和酶解（45°C）。依达拉奉的药理性质在第5.5、5.6和5.7节详细讨论。
琼脂糖立即在冰上冷却5分钟，然后在45°C进行凝胶内酶解10分钟。DNA团块被封闭在一个小而亮的核内。尽管2D-SCPFGE-0-150在两个方向上产生了长链纤维的延伸，但这些纤维中的一些仍然保留在原点的小而亮的核内。当琼脂糖在冰上冷却前在热板上于37°C孵育5分钟时，半固体凝胶允许精子头部肿胀而纤维不自由扩散。增加的空隙促进了蛋白酶K的渗透。肿胀后，第一次电泳导致从肿胀团块中释放出更多的长链DNA，而在第二次运行中以一定角度释放的纤维显著减少。该图谱表明肿胀解开了DNA纤维，使它们的去除更有效。在调亮ROI后，在扇形内角未观察到片段，根据研究者的暂定定义，这被认为是完整的。图4C，D分别显示了早期和晚期片段化阶段的典型图谱。如果琼脂糖在冷却前在42°C孵育10分钟，则精子头部熔化，DNA纤维在液化的琼脂糖中自由扩散。
同时凝胶内肿胀和酶解最关键的因子是将用于包埋的琼脂糖pH从4.7改为9.0。DTT中两个巯基残基的酸解离常数分别为9.2和10.1，这就是为什么鱼精蛋白之间的二硫键必须在pH高于9的条件下被还原。蛋白酶K的最适pH为8或更高。鱼精蛋白中精氨酸的胍基残基与DNA磷酸盐形成离子键，DTT和其他含硫酸盐的化合物（如SDS）在pH 9或以上可以竞争性地解离DNA-鱼精蛋白复合物，导致精子头部肿胀。在测试的有机化合物中，SDS表现出最强的肿胀活性。仅0.005% SDS就能在悬浮液中诱导头部肿胀，而在半固体琼脂糖中的最佳浓度为0.02%；更高浓度的SDS导致DNA纤维分散。
在先前的研究中，研究者使用高度纯化的牛胰蛋白酶进行凝胶内酶解。其底物特异性和pH依赖性对于消化DNA-鱼精蛋白复合物是最佳的。鱼精蛋白是富含精氨酸的碱性蛋白，胰蛋白酶特异性切割赖氨酸和精氨酸残基的羧基端。如果精子包埋在含有胰蛋白酶、pH 9.0的琼脂糖中，DNA会迅速扩散。由于胰蛋白酶活性严格依赖于pH，它可以保持在pH 4.7下无活性直到凝胶凝固，然后通过将凝胶浸入细胞裂解试剂（pH 8）中重新激活。市售的两次结晶牛胰蛋白酶通常被胰腺DNA酶污染，因此需要使用利马豆胰蛋白酶抑制剂偶联的Sephacryl进行亲和层析以去除自溶的胰蛋白酶和DNA酶。纯化的胰蛋白酶容易自溶，应存储在pH低于2.0的溶液中。虽然胰蛋白酶是凝胶内酶解的理想选择，但缺乏通用性。蛋白酶K具有胰凝乳蛋白酶样的广泛底物特异性，适
