结合ICP-MS技术的3D打印梯形螺旋芯片用于单细胞分析

《Analytica Chimica Acta》：3D Printing Integrated Trapezoidal Spiral Chip Coupled with ICP-MS for Single-Cells Analysis

本研究利用光固化3D打印技术构建集成微流控芯片，整合浓度梯度生成、细胞阵列培养和梯形螺旋聚焦单元，并与单细胞ICP-MS联用，实现高效、低损的单细胞银离子检测，显著提升细胞分析通量。

　　

尹云瑶|陈蓓蓓|何曼|胡斌

武汉大学化学系，中国武汉430072

摘要

背景

基于电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）的单细胞分析技术已经取得了显著进展。在本研究中，我们利用光固化3D打印技术构建了一种集成了浓度梯度生成、细胞培养阵列和梯形螺旋聚焦单元的微流控芯片，并开发了一种新的在线集成微流控芯片与单细胞（SC）-ICP-MS联用方法，用于测定单细胞中的银（Ag）含量。

结果

通过3D打印技术，可以制备出结构复杂、操作简便、成本低廉的微流控芯片。该方法实现了高通量的单细胞分析（每分钟63375个细胞），同时将细胞损失降至最低（细胞回收率约为94%）。以MCF-7细胞为代表，所提出的3D打印集成微流控芯片-SC-ICP-MS系统被用于检测暴露于Ag⁺或银纳米颗粒（AgNPs）的单个MCF-7细胞中的银含量。结果表明，在单细胞水平上，与暴露于Ag⁺的细胞相比，暴露于AgNPs的细胞表现出更明显的差异。

意义

本研究采用3D打印技术，使得芯片组件的集成更加便捷。通过将细胞培养直接集成在芯片上，无需额外的离芯片清洗步骤，从而建立了一个具有高细胞回收率和高通量的分析平台，使其成为单细胞分析的宝贵工具。

引言

细胞是生物体形态结构和生命活动的基本单位[1]，[2]。细胞过程中的固有随机性和变异性，包括基因表达、蛋白质合成和细胞代谢，是细胞群体内部异质性的基础[3]，[4]。虽然分析大量细胞群体可以获得平均结果，但这种方法可能导致误解并掩盖真实的生物学现象。相比之下，单细胞分析能够揭示和表征细胞间的差异。然而，这种方法面临重大挑战，主要是由于单个细胞的体积极小以及目标分析物的含量极低[5]，[6]。

单细胞检测方法包括多种技术，如免疫荧光成像[7]、表面增强拉曼光谱（SERS）[8]，[9]、电化学检测[10]，[11]、流式细胞术[12]，[13]以及电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）。与其他技术相比，ICP-MS在快速计数单细胞和直接定量单个细胞内的目标元素方面具有显著优势[14]。然而，当直接将细胞引入ICP时，由于气动雾化引入细胞悬浮液的过程是随机的，无法完全排除两个或多个细胞同时存在于一个离子射流中的可能性。微流控芯片作为一种理想的单细胞操作平台，具有微型化、多功能集成、操作简单和试剂消耗低等优点[15]。将微流控芯片与ICP-MS结合使用，可以实现单个细胞的精确处理和分离，从而便于进行准确定量。此外，在线分析功能减少了分析过程中样品丢失和污染的风险，提高了单细胞研究的可靠性和精度。

迄今为止，滴液微流控芯片已成功与ICP-MS结合用于单细胞分析[16]，[17]，[18]，[19]。通过将单细胞封装在滴液中，可以避免来自多个细胞的干扰信号。然而，选择用于生成油包水滴液的油相是一个关键因素，因为大多数有机溶剂与ICP离子源不兼容。Verboket等人[16]使用了高挥发性的全氟己烷作为有机相，但在使用定制的传输系统（包含加热器和膜脱溶剂）进行ICP-MS检测之前必须将其去除。在我们之前的研究中[17]，[18]，[19]，使用了高粘度和低碳含量的正己醇，这种溶剂可以直接通过微流式雾化器加入ICP-MS，并通入氧气（O₂）。然而，碳会在锥体上沉积。此外，根据泊松分布，为了确保单细胞封装，会产生大量空滴液，从而限制了样品通量。因此，建立一种高通量的单细胞分析系统至关重要，以提高检测通量并避免使用油相。

聚焦微流控芯片是另一种细胞操作平台，可以将细胞集中到一个流中以便后续进行单细胞检测。例如，Chen等人[20]利用负磁聚焦芯片与ICP-MS结合，实现了MCF-7细胞的高通量分析。Tang等人[21]开发了一种新的在线粘弹性流体聚焦芯片，并将其与ICP-MS结合，用于研究微囊藻细胞中HgS和Hg²⁺的生物积累。Zhang等人开发了一种螺旋惯性聚焦芯片，实现了无滴液的单细胞采样，从而能够实时进行ICP-MS分析以检测细胞内元素[22]，以及同时进行在线激光诱导荧光（LIF）和ICP-MS检测，以多参数分析单细胞水平的生物标志物表达和物质摄取[23]。上述研究表明，与滴液芯片系统相比，聚焦芯片避免了油相的引入，提高了样品通量。关于螺旋惯性聚焦芯片，广泛使用的是通过软光刻技术制造的矩形螺旋通道[24]。虽然有报道称梯形螺旋惯性微流控结构具有更好的分离效率[25]，[26]，[27]，[28]，但梯形横截面的螺旋改变了流速场，使得小颗粒更倾向于向外壁移动，而不影响大颗粒的聚焦位置[25]，从而在不同大小的颗粒之间产生更大的平衡位置差异，从而提高了分离分辨率。然而，传统的软光刻技术仅限于二维结构的制造，而制造不对称和复杂结构（如梯形螺旋惯性通道）需要高度复杂和昂贵的工艺。这一限制阻碍了梯形螺旋惯性通道在聚焦芯片中的广泛应用。

三维（3D）打印，也称为增材制造，具有低成本和可定制打印结构的优势[29]。因此，它为快速生产低成本且结构复杂的微流控芯片提供了有利工具。Zhang等人[30]使用3D打印模具制造了具有矩形凹形横截面的螺旋通道，用于高分辨率的颗粒和细胞聚焦与分离。他们实现了84.78%的癌细胞回收率和99.88%的血细胞去除率。同时，3D打印微流控芯片还可以为细胞培养提供三维微环境，便于体外细胞分析。例如，Wang等人[31]监测了癌细胞和成纤维细胞在实时3D基质环境中的迁移。这些进展表明，3D打印技术为设计结合细胞培养和聚焦功能的微流控芯片提供了新的机会。预计结合ICP-MS的更高度集成的微流控芯片将实现更高效的单细胞分析平台，具有更高的通量、更少的手动干预和更低的细胞样品损失。

本研究旨在设计一种3D打印微流控芯片，该芯片集成有浓度梯度生成、细胞培养阵列和梯形螺旋惯性聚焦通道，并将其与ICP-MS结合，用于在线检测暴露于Ag⁺和AgNPs的单个MCF-7细胞（图1）。首先，将MCF-7细胞接种在五个细胞培养室中，然后通过浓度梯度生成器引入含有Ag⁺或AgNPs的无血清培养基，与MCF-7细胞在不同暴露浓度下孵育。孵育后，通过气体阀门系统依次打开五个细胞培养室的出口阀门，使不同培养室中的细胞依次进入梯形螺旋惯性聚焦芯片。在梯形螺旋通道内，细胞被聚焦成一个流，然后引导至螺旋通道的内侧出口，并在线引入ICP-MS进行单细胞检测。

试剂和仪器

本研究中使用的材料、试剂和缓冲液列在支持信息中的Text S1中。MCF-7（人类乳腺癌）细胞由Procell Life Technologies Ltd.（中国武汉）提供，细胞培养的详细信息在Text S2中描述。

使用Agilent 8900 ICP-MS（Agilent，日本）进行单细胞检测，主要操作条件列在表S1中。实验中使用的其他仪器列在Text S3和表S2中。

集成微流控芯片的设计与制造

微流控

设计芯片的可行性

该芯片由两部分组成。第一部分是浓度梯度混合器和细胞培养室阵列芯片。第二部分是梯形螺旋芯片。系统研究了设计芯片的可行性及梯形螺旋芯片的优化。

浓度梯度生成器的可行性。使用COMSOL Multiphysics 6.0软件模拟了设计浓度梯度生成器的浓度场和速度场（如图所示）

结论

在本研究中，我们利用光固化3D打印技术构建了一种集成浓度梯度生成、细胞培养阵列和梯形螺旋聚焦单元的微流控装置，并将其与SC-ICP-MS结合用于在线单细胞分析。在优化条件下，该方法可实现高通量分析（每分钟63375个细胞），且细胞损失很小（MCF-7细胞的回收率为93.81%）。所开发的方法

作者贡献声明

何曼：撰写 – 审稿与编辑。胡斌：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学、资金获取。尹云瑶：撰写 – 原始稿撰写、方法学、实验设计、数据分析。陈蓓蓓：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学、概念构思

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的利益冲突。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：22374111、21974100、21775113）和中国教育部的财政支持。