用于MALDI质谱成像的非脱钙人类牙齿样本制备方法

《Analytica Chimica Acta》：Non-Decalcified Human Teeth Sample Preparation Method for MALDI Mass Spectrometry Imaging

牙齿作为生物样本的时空分子分析技术优化。

　　

Kayle J. Bender|Joanna E. Spurgeon|Chuo Ying Zhai|Manish Arora|Elizabeth K. Neumann

加州大学戴维斯分校化学系，美国加利福尼亚州戴维斯市One Shields Avenue 95616

摘要

背景

人类牙齿在整个生命过程中保存了丰富的生物和环境信息。要获取这些信息，需要具备空间和化学分辨率的分析技术。基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI MSI）在可视化生物分子的空间分布方面具有强大的能力。然而，成功的分析要求保持牙齿的形态和化学完整性。牙釉质和牙本质的坚硬和脆性是一个主要挑战，因为制备足够薄的切片通常需要脱钙处理，而这可能会影响分子成分。

结果

在这项研究中，我们提出了一种使用冷冻膜、包埋技术和特定冷冻切片刀片的样品制备方法，使得能够使用MALDI MSI分析未脱钙的人类牙齿。我们进一步通过多种MALDI基质验证了这种方法，展示了其在牙齿生物分子空间分析中的潜力。

意义

这种方法为未来研究人类牙齿中小分子的空间和时间分布奠定了基础。

引言

牙齿是由牙釉质、牙本质和牙髓腔组成的矿化结构。¹牙釉质构成了牙齿的外表面，由于其高钙含量，被认为是人体中最坚硬的生物组织。²牙釉质下面是牙本质，它具有随着时间逐渐形成的分层结构。^{3>新生儿线在出生时形成于牙本质和牙釉质中，是区分产前和产后生长的组织学特征。4牙本质中的这些逐层生长层具有很高的信息价值，因为它们在羟基磷灰石矿化过程中捕获了血液中的分子，从而提供了时间分辨的化学档案。5}

特别是早期脱落的乳牙，已成为重建环境暴露历史的宝贵无创生物样本。牙齿的化学成分已被用于评估早期对金属和其他毒物的暴露情况，相关研究将这些暴露与不良发育结果联系起来。^{(6), (7), (8), (9), (10), (11)}例如，在子宫内和出生后早期接触烟草烟雾后，已在大鼠牙本质中检测到尼古丁代谢物⁽¹²⁾，而产前酒精暴露与氨基酸谱的紊乱有关⁽¹¹⁾。此外，牙齿中改变的金属积累模式与自闭症谱系障碍等神经发育状况⁽⁹⁾以及与口腔健康不良相关的全身性疾病（如心血管疾病）⁽¹³⁾有关。

尽管牙齿具有丰富的时间记录，但由于其硬度，其在空间分辨分子分析中的用途一直受到限制。通常在将牙齿大规模粉碎或进行显著化学降解后进行研究，这会导致嵌入牙本质层中的时间信息丢失。^{(14), (15)}脱钙后的切片可以保留某些蛋白质的空间信息，但引入EDTA会破坏小分子的分布，并且需要较长的处理时间⁽¹⁶⁾。不进行脱钙或其他处理的牙齿包埋和切片可以保持牙齿的空间和分子完整性，从而能够对环境暴露和内源性生物分子内容进行年龄对齐的映射。因此，牙齿的空间分析可以回顾性地评估特定年龄的暴露情况和生理状态，尤其是与已知发育标志物（如新生儿线）结合使用时。例如，天冬氨酸会随时间以立体特异性方式积累，从而可以通过外消旋化指标进行年龄估计^{(17), (18)}。蛋白质组学研究也在考古样本中发现了保存的牙釉质蛋白质，揭示了长期生物分子稳定性的潜力⁽¹⁹⁾。当这些分子谱在原位保存和可视化时，可以提供关于发育历史、环境暴露和生理变化的多维视图。

基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI MSI）特别适合这种空间分辨的分子分析⁽²⁰⁾。在这种技术中，新鲜冷冻的生物样本被切成约10微米的厚度，然后粘贴在导电的氧化铟锡（ITO）载玻片上，并涂覆一层吸收紫外线的基质以促进解吸和电离。紫外激光在组织上扫描，生成定义好的空间间隔的质量谱。这些数据可以重建为10微米级别的离子图像，揭示代谢物^{(21), (22), (23)}、脂质^{(21), (24), (25)}、肽^{(26), (27)}、蛋白质^{(20), (28)}和其他分子的空间分布。虽然这种方法已广泛应用于软组织，但制备完整、未脱钙的硬组织（如人类牙齿）在技术上存在重大挑战^{(29), (30), (31)}，因此冷冻膜或胶带对于保持薄矿化组织的完整性至关重要⁽²⁹⁾。之前的研究中使用了Kawamoto的薄膜方法⁽²⁹⁾进行样品切片。冷冻膜技术已扩展到骨骼^{(30), (32), (33)}、大鼠脊柱⁽³¹⁾、整个小鼠头部⁽³⁴⁾、整个小鼠身体的质谱成像样品制备⁽³⁵⁾。然而，牙齿作为最坚硬、钙化程度最高的生物组织，带来了独特的挑战⁽²⁾。本研究旨在通过开发一种稳健的协议，克服牙齿硬度和脆性的限制，以便对未脱钙的乳牙和恒牙进行MALDI MSI分析。在这里，我们展示了使用冷冻膜可以在未脱钙的未固定人类牙齿中检测到许多特征。

化学试剂

所有化学品均从Sigma Aldrich购买，除非另有说明，否则无需进一步纯化即可使用。

牙齿采集与切片

六颗完整的牙齿（一颗恒尖牙、一颗恒磨牙、一颗乳尖牙和三颗乳磨牙）来自匿名患者，根据结构完整性进行挑选。这些患者没有已知的遗传疾病。未脱钙、未固定的人类牙齿被嵌入2.6%、4%、5.25%或7%的羧甲基纤维素（CMC；EMD Millipore Corp., Burlington, MA）中，并在-80℃下保存

MALDI Q-TOF MSI

MALDI MSI实验使用的是timsTOF fleX双源MALDI质谱仪（Bruker Scientific, Billerica, MA）。实验在正离子模式或负离子模式下进行，光栅宽度为30 μm × 30 μm。这里的光栅宽度用于描述每次激光消融扫描的区域。牙齿在正离子模式下被用于分析脂质、肽和小分子代谢物，在负离子模式下用于分析脂质。

结果与讨论

由于牙齿本身的脆性和成分不均匀，对其的切片存在显著的机械挑战。在这里，我们评估了嵌入介质中羧甲基纤维素（CMC）浓度在成功进行未脱钙人类牙齿冷冻切片中的作用，以确定所需的最小浓度。一个关键的观察结果是，如果不将牙齿嵌入CMC中直接切片，会导致牙齿碎裂

结论

本研究概述了一种用于MALDI质谱成像（MSI）的未脱钙人类牙齿制备方法，实现了对完整矿化牙科组织的空间分辨化学分析。通过使用完整的矿化牙科组织，避免了脱钙化学处理带来的风险，从而保留了内源性分子。关键技术组件包括使用冷冻膜在切片转移过程中保持空间精度，以及使用坚固的碳化钨刀片

CRediT作者贡献声明

Kayle J. Bender：撰写——原始草稿、方法论、研究、正式分析。Joanna E. Spurgeon：撰写——审阅与编辑、方法论、研究、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。Chuo Ying Zhai：撰写——审阅与编辑、方法论、研究。Manish Arora：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目协调、概念化。Elizabeth Neumann：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿

利益冲突声明

JES和MA是Linus Biotechnology的员工。EKN是Linus Biotechnology的顾问。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：

Elizabeth Neumann报告称，美国国立卫生研究院提供了财务支持、设备和物资。Elizabeth Neumann报告称，Linus Biotechnology Inc.提供了设备和物资。Joanna Spurgeon报告称，Linus Biotechnology Inc.提供了财务支持。Mannish Arora报告称，...

致谢

作者感谢加州大学戴维斯分校和NIHNIA（1R21AG083965-01A1）的资助。作者感谢Linus公司提供的实验所需物资。