在酸性pH条件下，通过系统优化无凝胶毛细管区电泳技术来实现磷酸二酯寡核苷酸的分离

《Analytica Chimica Acta》：Systematic optimization of gel-free capillary zone electrophoresis for phosphodiester oligonucleotide separations at acidic pH

本工作设计并制备了三种含联吡啶的杂苯基混合凝胶柱，利用超分子亲和色谱策略高效分离CB[5]和CB[7]，优化色谱条件后成功获得高纯度产物（CB[5]产率30.0%，CB[7]25.0%），为制备高纯度葫芦[n]尿斯提供了新方法。

　　

沈小龙|唐瑞志|马书娟|边洋洋|唐志超|欧俊杰

中国西北大学化学与材料科学学院，西安，710127

摘要

背景

葫芦[n]脲（CB[n]）是一类星形大环分子，在多个领域获得了广泛应用，包括钙钛矿电池、吸附分离、室温磷光和生物分子科学等。获得高纯度的CB[n]是一个重大挑战，尤其是对于没有有机合成和纯化专门背景的研究人员来说。由于CB[7]和CB[5]的溶解度和化学性质相似，分离它们非常困难。因此，开发特定和选择性的色谱方法是高效分离CB[n]同系物的必要条件。

结果

在这项工作中，通过“一锅法”设计并制备了三种含有联吡啶的混合整体材料，然后将其作为吸附平台，利用超分子亲和色谱策略分离CB[5]和CB[7]。这种新方法基于CB[5]和CB[7]对联吡啶客体分子的差异性识别机制实现高效分离。与聚合物链中的客体分子相比，将客体分子暴露在吸附剂表面的末端有利于提高CB[7]的特异性吸附能力。在优化色谱条件后，成功从40毫克的粗产品中分离出了12毫克的CB[5]和10毫克的CB[7]，纯度分别达到30.0%和25.0%。

意义

这项工作首次引入了基于特定和可逆主客体相互作用的混合整体材料及分离策略，简化了CB[5]和CB[7]的纯化过程，并通过MALDI-TOF MS准确确定了它们的纯度。这种方法有望成为制备高纯度CB[n]同系物的可靠实验室方法。

引言

葫芦[n]脲（CB[n]）是由甘醇脲单元通过亚甲基桥连接而成的大环分子，形成刚性且高度对称的结构。它们独特的分子结构赋予了它们卓越的分子识别能力。特别是，其疏水腔和两个端口的负电羰基可以通过多种非共价相互作用结合多种客体分子[1]、[2]、[3]。因此，CB[n]被广泛应用于钙钛矿电池[4]、吸附分离[5]、[6]、[7]、室温磷光[9]、[10]、[11]、生物分子科学[12]、[13]等领域。由于CB[5]的疏水腔较小，它只能结合某些气体分子或阳离子[15]。例如，Zhou[16]利用CB[5]的疏水腔抑制SnO₂中的氧空位并防止颗粒聚集，设计了一种高效稳定的钙钛矿太阳能电池。CB[5]的羰基被用于协调稀土金属离子，以制备用于检测L-色氨酸的荧光传感材料[17]。CB[7]由于腔体较大，能够结合较大的客体分子，因此受到了多个学科研究人员的广泛关注。研究表明，CB[7]的大腔不仅可以封装芳香化合物以开发长寿命的室温磷光材料[18]，还可以利用其动态调节能力控制客体分子的结合，从而可逆地调控DNA螺旋结构[19]。显然，CB[5]和CB[7]引起了多个学科研究人员的极大兴趣。在分析化学领域，Wang[20]利用CB[7]对N末端苯丙氨酸的高亲和力实现了诱饵蛋白HP1β染色域的位点特异性固定。随后通过金刚烷胺的竞争性置换实现了捕获的甲基赖氨酸蛋白的非变性和无痕释放。该方法结合质谱技术，高效纯化和鉴定了癌细胞中的甲基赖氨酸蛋白组。Zhan[21]通过CB[7]与L-苯丙氨酸的超分子自组装，增强了配体稳定的金纳米簇的表面稳定性，从而提高了它们的电化学发光效率和整体稳定性。

通常，葫芦[n]脲（CB[n]）是以不同数量的甘醇脲单元组成的混合物，包括CB[5]、CB[6]、CB[7]和CB[8]。获得高纯度的CB[n]仍然是一个挑战，尤其是对于没有有机合成和纯化专门背景的研究人员来说。由于CB[7]和CB[5]的溶解度和化学性质相似，纯化它们非常困难。Kim[22]提出了一种基于溶解度差异分离CB[n]的常用方法。CB[6]和CB[8]在水中的溶解度明显低于CB[5]和CB[7][23]。此外，可以通过它们在盐酸溶液中的不同溶解度来分离CB[6]和CB[8]。然而，由于CB[5]和CB[7]的溶解度相似，分离效率有限，给完全纯化带来了挑战。此外，这种方法消耗大量有机溶剂，并需要多次洗涤和蒸发溶剂。相比之下，利用CB[5]和CB[7]对客体分子的选择性差异进行分离是一种更有效的策略。Scherman的团队[24]、[25]提出了一种新的分离策略，引入了一种[Cnmim]Br型烷基咪唑离子液体客体，能够选择性地结合CB[7]，形成固态离子复合物，最终实现纯CB[7]的分离。但这种方法操作复杂，需要几天时间。特别是CB[7]的回收需要一个繁琐的客体分子络合过程。Sletten[26]设计了一种客体分子——碳硼烷，其结合亲和力可以通过化学反应进行调整，从而实现CB[7]的成功回收和重复使用。本工作提出，客体与主体之间的结合常数影响CB[7]的回收效率。然而，这类分子的合成具有挑战性，难以在试点规模上推广。实际上，这些开创性的研究启发我们基于它们的超分子亲和性差异来分离CB[5]和CB[7][27]。亲和色谱在样品制备和纯化中起着重要作用，因为它具有高亲和力、高选择性和特异性洗脱[28]、[29]、[30]、[31]、[32]。因此，开发特定和选择性的超分子亲和色谱方法可以是高效分离CB[n]同系物的替代方案。

本文提出了一种基于选择性分子识别的亲和色谱策略，用于分离CB[5]和CB[7]。分别使用1,1′-bis[(4-乙烯基苯)]-4,4′-联吡啶inium氯化物（BVBp）、4,4'-联吡啶（Bp）和1-苯基-4,4'-联吡啶inium（BBp）作为前驱体，制备了三种含有联吡啶客体分子的整体材料（图1），然后将其用作SPE柱。基于主客体分子之间的非共价相互作用，系统研究了CB[5]和CB[7]在这三种整体材料上的不同结合亲和力。在优化SPE条件后，成功获得了高纯度的CB[5]和CB[7]。

化学试剂和材料

苯基氯、2,5-二羟基苯甲酸（DHB）、4-乙烯基苯基氯、4,4'-联吡啶、四氢呋喃（THF）、尿素、甘醇脲、甲醛、聚乙二醇10000（PEG-10000）、四甲基正硅酸盐（TMOS）、乙醇、3-氯丙基三甲氧基硅烷（CPTMS）和2,2'-偶氮二(2-甲基丙腈）（AIBN）从Aladdin（中国上海）购买。乙腈（ACN）、盐酸（HCl）、甲醇和醋酸（HOAc）从Kemiou（中国天津）购买。

混合整体材料的制备与表征

有机-硅基混合整体柱结合了有机和硅基整体材料的优点，如高稳定性、良好的机械性能和简便的制备过程。在本工作中，设计了三种含有联吡啶客体分子的混合整体材料，并根据联吡啶两侧连接的苯基数量进行了区分。这些混合整体材料的制备过程如表1所示。

结论

基于对联吡啶客体分子的不同识别机制，成功建立了一种超分子亲和色谱方法来分离CB[5]和CB[7]。通过“一锅法”设计并制备了三种含有联吡啶的混合整体材料，然后将其作为吸附平台用于分离CB[5]和CB[7]。观察到CB[7]在固定相中的保留能力

CRediT作者贡献声明

沈小龙：撰写——原始稿件，实验研究。唐瑞志：撰写——原始稿件，实验研究。马书娟：指导，资金获取。边洋洋：撰写——审稿与编辑，指导，资金获取。唐志超：资源提供。欧俊杰：撰写——审稿与编辑，指导，资金获取

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号22374115）对J. Ou的支持，以及国家自然科学基金（编号22174139）和CAS-Weigao研究与发展计划（[2025]-002）对S. Ma的支持。