LC-MS技术用于甘油三酯水解的测定：在研究含有Patatin样磷脂酶结构域的蛋白质3（Patatin-like phospholipase domain-containing protein 3）活性中的应用
《Analytical Biochemistry》：LC-MS measurement of triglyceride hydrolysis: Application in studies of Patatin-like phospholipase domain-containing protein 3 activity
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甘油三酯积累与疾病关联密切，开发高灵敏度非放射性检测方法对筛选小分子药物至关重要。本研究通过优化液相色谱-质谱联用技术，建立以二油酰甘油裂解产物的定量检测为核心的PNPLA3活性分析方法，成功实现了 wild type与I148M突变体酶活性的差异检测，Z'值达0.78，信号背景比60:1，为肝脂代谢药物研发提供了可靠工具。
Xun Chen|Markus Koglin|Michael C. Gregory|Kevin H. Nguyen|Serena Xu|Richard Johnstone|Anthony Kreamer|Andy Liaw|Mary Jo Wildey|Salman Jabri|Yingjiang Zhou|Saswata Talukdar|Haihong Zhou|Adam Weinglass|Payal R. Sheth|Kenneth Ellsworth|David G. McLaren|Stephen F. Previs
默克公司（Merck & Co., Inc.），地址：美国新泽西州拉韦市（Rahway, NJ）林肯大道东126号（126 E. Lincoln Ave.），邮编07065
摘要
甘油三酯的积累与多种疾病状态相关，因此，通过增强影响甘油三酯的靶点来调节脂滴生物学特性是一个有吸引力的研究领域。遗憾的是，目前可用于高通量检测脂肪酶活性的方法选择有限，尤其是那些不使用放射性标记物的方法。液相色谱-质谱（LC-MS）分析技术有助于筛选小分子药物候选物。作为一种检测方法，LC-MS具有较高的灵敏度和特异性，并且能够实现规模化操作以提高检测通量。本文我们开发并验证了一种用于检测含Patatin样磷脂酶结构域蛋白3（PNPLA3）活性的方法。由于文献表明PNPLA3突变与脂肪肝的病理生理过程有关，我们优化了该检测方法，以便能够研究野生型和I148M突变形式的PNPLA3。初步研究使用油酸作为检测指标，但为了提高灵敏度（从而减少对蛋白质的需求，尤其是对于I148M突变体），最终版本的方法是在384孔板中测量二油精的生成情况。实验结果显示良好的重复性（Z’约为0.78）以及足够的信噪比（约60:1）。总之，通过水解三油精并随后定量二油精的方法，可以有效地检测脂肪酶活性。
引言
肝脏中甘油三酯的积累与多种负面健康后果相关，包括胰岛素抵抗、糖尿病、心血管疾病和肝衰竭[[1], [2], [3]]。目前，亟需能够调节肝脏脂质水平并延缓疾病进展的疗法[4,5]。为实现这一目标，可以采取不同的策略。例如，在代谢途径活性层面，阻断甘油三酯的形成[6]、分离脂肪酸的氧化过程[7,8]，或调节线粒体或过氧化物酶体生物学中的缺陷[9,10]都是可行的方法。
对相关靶点的进一步研究显示，含Patatin样磷脂酶结构域蛋白3（PNPLA3）的突变与脂质积累密切相关，这使得PNPLA3成为一个值得关注的研究目标[11]。尽管Huang等人的初步研究测量了放射性标记的甘油三酯的水解情况[11]，Hao等人建立的LC-MS方法用于定量脂肪酶活性[12]，但使用非放射性方法来测量PNPLA3活性的选择仍然有限，尤其是那些适用于高通量筛选的方法。
基于Huang等人开发的实验框架[11]，我们将放射性标记的甘油三酯底物替换为稳定同位素示踪剂，并利用质谱技术来检测产物（包括脂肪酸和甘油二酯的生成）。本文介绍了新型质谱检测方法的开发过程，并展示了其在野生型和突变型PNPLA3研究中的应用。
材料与方法
试剂：Tris-HCl缓冲液（1.0 M，pH 7.0）购自Boston BioProducts（马萨诸塞州阿什兰，Ashland, MA）。13C5甘油三油酸（1,2,3,7,8-13C5）、13C18油酸、磷脂酰胆碱、氯化镁、脱氧胆酸钠、n-十二烷基-B-麦芽糖苷（DDM）、DMSO、甲酸铵和乙醇均购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯，St. Louis, MO）。1,2-二油酰-rac-甘油-13C3和(R)-溴烯醇内酯购自Cayman Chemical（密歇根州安娜堡，Ann Arbor, MI）。Tris（2-羧乙基）膦（TCEP）购自Thermo
结果与讨论
非酒精性脂肪肝已成为一个严重的公共卫生问题，而PNPLA3是一个值得研究的靶点[13,14]。目前，针对这种复杂疾病的治疗选择仍然有限，Rezdiffra是唯一获得FDA批准的用于治疗伴有肝纤维化的NASH成年患者的药物。PNPLA3是一种与脂滴相关的蛋白质，其I148M突变体通过全基因组关联研究（GWAS）被确认为与肝脏脂肪含量最相关的遗传因素。
CRediT作者贡献声明
Xun Chen：撰写原始稿件，参与研究。Markus Koglin：撰写原始稿件，提供监督和概念指导。Michael C. Gregory：撰写原始稿件，参与研究并提供概念指导。Kevin H. Nguyen：参与研究。Serena Xu：撰写原始稿件，参与研究。Richard Johnstone：提供监督和概念指导。Anthony Kreamer：参与研究并提供概念指导。Andy Liaw：参与研究并提供概念指导。Mary Jo Wildey：提供监督和概念指导。Salman Jabri：
利益冲突声明
作者声明在本文的研究工作中不存在任何可能影响研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
所有作者在完成本项工作时均受雇于默克公司（Merck & Co., Inc.）的新泽西州拉韦分公司（Merck Sharp & Dohme LLC），并且/或在该公司持有股票。同时，我们也感谢Steve Stout在方法开发初期提供的宝贵指导。
