《Analytical Biochemistry》：Ultrasensitive quantification and comprehensive evaluation of nicking endonuclease efficiency
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单分子计数法揭示多种DNA内切酶的切割效率均达99.6%以上，NEs整体效率优于Type II限制酶并呈现更窄分布差异，为酶工程提供新工具。
张毅|石渡千惠子|工藤典子|岛村茂|黑泽香奈子|西浦大辅|横川泰一
SUGAR项目，X-star，日本海洋地球科学技术机构（JAMSTEC），横须贺237-0061，日本
摘要
序列特异性切割内切酶（NEs）在双链DNA（dsDNA）上的行为类似于限制性内切酶（REs），但它们只切割其中一条链而不是两条链。这一独特性质使得NEs在某些应用中不可或缺，并对基于酶的生物技术产生了深远影响。尽管NEs具有关键作用，但由于缺乏敏感且直接的检测方法，对其一般反应效率的基础研究一直受到限制。本研究采用了单分子计数技术，实现了对各种NEs（包括经典型和可编程型）切割效率的超灵敏量化。DNA底物经过序列优化，以便能够同时测量不同酶的作用。无论哪条链被切割，都会导致底物降解。未被切割的单个DNA分子可以作为模板，在大规模并行的液滴反应器中启动荧光蛋白合成，从而实现对未被切割DNA部分以及切割效率的数字化定量。没有任何NEs能够完全消耗底物DNA。目前可用的NEs的平均切割效率为99.6%。总体而言，NEs的表现优于II型REs，这体现在更高的平均效率以及更窄的效率分布上。积累的数据集进一步允许进行群体水平的统计分析，将NEs与REs之间的效率差异归因于它们的基本切割特性。这些全面的测量结果提供了关于DNA切割酶反应效率的第一个整体视角。本研究建立的方法和获得的知识可能为未来的研究提供工具和见解，无论是扩展酶的库还是探究涉及NEs的生物现象。
引言
切割内切酶（NE）[1]与II型限制性内切酶（RE）[2]一样，能够识别双链DNA（dsDNA），但只切割两条互补链中的一条，这一点使其区别于传统的REs。REs对DNA分子的酶促切割是分子生物学黄金时代重组DNA技术的基础之一。高特异性和分子多样性使得REs成为常规基因工程应用中的必备工具，尽管最近的无缝组装技术可以提供不依赖DNA限制位点的替代方案。在克隆和表征各种REs的过程中，最初发现的少数NEs显示出独特的单链切割能力，这一能力后来极大地扩展了基因操作的领域。双链识别能力赋予了NEs与REs相似的特异性，而单链切割能力则使NEs真正不可或缺，因为没有其他替代品。
近年来，与NEs相关的最显著的应用包括快速体外诊断（IVD）用于传染病检测、高通量定向进化用于蛋白质工程，以及具有较低脱靶突变的基因组编辑。例如，NEs极大地增强了等温扩增技术，使得IVD检测能够以极快的速度（通常只需几分钟，属于有记录以来最快的速度之一）进行，同时保持良好的灵敏度和特异性，从而在公共卫生紧急情况下实现可靠的即时检测[3]，[4]。回顾性地看，在PCR发明后不久，人们就提出了绕过耗时热循环的方法[5]，例如基于链置换的扩增——这是所有等温扩增反应共有的基本机制，这些反应本质上不需要热变性步骤[6]。这种反应设置的简单性和出色的扩增性能在NE出现之前十多年里几乎没有得到充分利用。NE的引入[7]取代了早期版本中的RE[8]，[9]，实现了无需依赖改性dNTP（脱氧核苷三磷酸）类似物的直接单链切割[10]，因为后者成本高昂、容易出错（降低扩增保真度），并且被DNA聚合酶的结合效率较低[11]。不仅对于核酸扩增，对于蛋白质工程而言，能够在dsDNA中引入特定的单链切割（即切割突变）的能力也扩展了快速（单日）和便捷（一锅法）构建DNA文库的工具箱[12]。它通过从质粒dsDNA的切割位点开始选择性消化单链，大大简化了突变文库的制备过程，同时保持另一条链完整，作为突变引物的退火模板——这是在没有NE的情况下无法实现的。当使用一对工程化的Cas9版本[13]时，一个版本切割一条链，另一个版本切割附近的另一条链，这种基因组编辑方法将脱靶频率降低了三个数量级[14]。高特异性得益于细胞修复机制，该机制能够有效修复单个错位的切割点——而对于野生型Cas9产生的双链断裂来说，这一过程出错率要高得多。除了CRISPR/Cas系统和限制修饰系统[15]之外，人们还持续关注和探索各种细菌防御系统的隐藏世界[16]，例如Gabija，这是一种最近被发现的天然免疫系统，其中包含一种与所有已知天然或人工NE都不同的ATP依赖性NE[17]。这类新型酶的发现往往激发了关于抗噬菌体防御机制的新思考和推理[18]，[19]。对于潜在的生物分析应用，对特定辅因子的依赖性也可能提供一种在空间或时间上调节酶活性的额外手段。
尽管NEs在阐明分子途径和实现各种应用中起着关键作用，但由于缺乏便捷且灵敏的分析方法，其催化效率——对其生物技术应用至关重要——仍然知之甚少。几十年来，DNA电泳一直是判断酶切割反应程度的唯一广泛使用和标准方法。由于NEs只在一条链上产生一个切割点并且不会使DNA断裂，因此底物dsDNA的长度和双链结构得以完整保留，尤其是在使用线性DNA时。因此，评估NE性能的常规方法是基于分离不同拓扑结构的环状质粒DNA。具体来说，切割处理会将超螺旋质粒转化为松弛的开放环状结构，这些结构在电泳中的迁移率不同，从而改变了凝胶上不同构象的相对比例。然而，凝胶电泳的灵敏度较低（检测限：每条带几纳克）[20]以及电泳图谱解释的模糊性（由于超螺旋程度的变化[21]和线性DNA的频繁存在）长期以来阻碍了切割效率的明确、定量或灵敏的测量。
本研究将单分子计数方法扩展到了NEs的应用，该方法为DNA切割酶的超灵敏（比凝胶电泳高10^6倍）和定量重新评估提供了新的框架[20]。正如之前对REs的研究[20]所揭示的，限制反应中的DNA消化通常远未完成，特别是考虑到仍有大量分子未被切割的情况。不同酶的切割效率也有很大差异。因此，有必要质疑这一结论是否也适用于特殊的DNA切割酶。除了少数天然NEs外，大多数现有的NEs都是从REs工程改造而来的[1]。目前尚不清楚这些工程化的人工酶是否与其亲本REs具有相同的效率。明确了解NEs的常规切割效率对于它们的正确应用以及准确解释它们参与的生化过程至关重要。这项工作首次全面展示了各种NEs的酶促切割效率。为此，理想情况下需要有一种通用的DNA底物，能够涵盖所有现有NEs的识别位点。NEs被视为REs的一个子组，由于它们的催化机制相似且经常直接从REs衍生而来，因此尚未被赋予独立的EC（酶委员会）编号。为了方便起见，本研究将NEs作为一个与REs平行的独立组别进行讨论。
部分摘录
模板质粒DNA的制备
设计了一种经过广泛改造的pRSET-B（Invitrogen）质粒，用于基于T7启动子的、经过密码子优化的mNeonGreen（一种荧光蛋白[22]）表达。简而言之，mNeonGreen基因由Eurofins Genomics合成，并使用一种无缝且不依赖连接的克隆技术（In-Fusion Snap Assembly Master Mix，Takara-Bio）插入pRSET-B载体中，同时去除了原始载体的N端标签（6×His标签、T7标签和Xpress标签）。插入的mNeonGreen
基于单分子计数的切割效率测量原理
单分子计数方法使得能够在限制消化反应中对底物DNA进行定量追踪分析[20]。该方法通过将DNA切割事件与蛋白质表达结果相关联来检测DNA链的完整性，使用的是经过工程改造的模板DNA，在无细胞系统中表达标记蛋白（例如荧光蛋白）。
结论
我们提出并验证了一种基于单分子计数的通用方法，用于超灵敏和定量测量仅切割DNA一条链的DNA切割酶的反应效率。借助T5外切酶和数字蛋白质合成技术，DNA链上是否存在单个切割点被转化为单个DNA分子上荧光蛋白表达的开启/关闭状态，从而生成数字读数。
CRediT作者贡献声明
工藤典子：研究、数据管理。西浦大辅：软件、资源、项目管理、正式分析、验证、撰写——审稿与编辑。横川泰一：撰写——审稿与编辑、资源、项目管理、资金获取。岛村茂：研究、数据管理、资源。黑泽香奈子：研究。张毅：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、项目管理、方法学研究，
利益冲突声明
作者声明他们没有可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
利益冲突声明
? 作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的竞争利益：张毅报告称获得了日本学术振兴会的财务支持。横川泰一报告称获得了日本学术振兴会的财务支持。张毅报告称获得了日本文部科学省的财务支持。如果有其他作者，他们
